[發(fā)明專利]一種聯(lián)苯降解菌的單細(xì)胞分離快速篩選方法

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• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112029692A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈超峰;劉澤釩;徐豐俊;陳柯蓁;符玉龍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12R1/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 傅朝棟;張法高

本發(fā)明公開了一種聯(lián)苯降解菌的單細(xì)胞分離快速篩選方法，包括對自然土樣進(jìn)行預(yù)處理后密度梯度離心的中下層液體為純凈菌液；將其稀釋至所需濃度后以單個液滴的形式分別注入到細(xì)胞培養(yǎng)板的每個微孔中，使每顆液滴中包含一至幾個菌體；恒溫震蕩培養(yǎng)，定期測定每個微孔中的菌量和聯(lián)苯降解中間產(chǎn)物量，并分別繪制每個微孔中菌量和中間產(chǎn)物量隨時間的變化曲線；吸取曲線出峰的微孔中的菌液，將其涂布于噴灑聯(lián)苯的無機鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)形成菌落后鑒定其屬種。本發(fā)明省去了富集培養(yǎng)與分離純化的步驟，直接從單細(xì)胞層面進(jìn)行培養(yǎng)與鑒別，大大節(jié)省了篩選新菌株所需的時間，本發(fā)明不止能用于篩選聯(lián)苯降解菌，也可以推廣到篩選其它合適的環(huán)境功能菌。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種聯(lián)苯降解菌的單細(xì)胞分離快速篩選方法。

背景技術(shù)

聯(lián)苯(Diphenyl)是一類重要的有機原料，被用于合成增塑劑、防腐劑、制造燃料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域中。但同時，聯(lián)苯難降解，易揮發(fā)，本身具有一定毒性，大量吸入能導(dǎo)致肌肉萎縮，損害中樞系統(tǒng)和肝臟，是一類常見的有機污染物。多氯聯(lián)苯(Polychorinated biphenyls，PCBs)是聯(lián)苯的一類同系物，由聯(lián)苯中的氫原子被氯原子不同程度取代所形成。因為其難降解性和高生物毒性，目前受到廣泛關(guān)注。據(jù)報道，聯(lián)苯降解微生物同樣具有降解多氯聯(lián)苯的能力。

針對聯(lián)苯污染的土壤，常用的修復(fù)方法包括物理法(客土法、熱處理、淋洗法等)以及化學(xué)法(化學(xué)氧化還原法)。但這些方法大多存在對土壤結(jié)構(gòu)破壞大、易造成二次污染、不夠經(jīng)濟等問題，更適用于修復(fù)污染濃度高的小塊污染場地。而利用微生物降解聯(lián)苯的生物修復(fù)法，因為安全、經(jīng)濟、環(huán)保等優(yōu)點，成為該領(lǐng)域的研究熱點。

生物修復(fù)法的關(guān)鍵是要有能高效降解聯(lián)苯的菌種。而目前常用的聯(lián)苯降解菌篩選方法，需要富集馴化與分離純化，富集培養(yǎng)需要連續(xù)傳代數(shù)次，每一代需要培養(yǎng)數(shù)天，分離純化也需要連續(xù)劃線數(shù)次。這些步驟耗費時間較多，降低了篩選新菌種的效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對土壤中聯(lián)苯降解菌的傳統(tǒng)篩選方法步驟多、耗時長、篩選效率低的問題，提供了一種簡單、高通量的聯(lián)苯降解菌的單細(xì)胞分離快速篩選方法。

本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下：

一種聯(lián)苯降解菌的單細(xì)胞分離快速篩選方法，其具體如下：

S1：對自然土樣進(jìn)行預(yù)處理以去除雜質(zhì)，得到初始菌液；

S2：對所述初始菌液密度梯度離心，棄去一半體積的上層清液后，剩余的中下層液體為不含土壤顆粒的純凈菌液；

S3：確定所述純凈菌液的菌濃度，并將其稀釋至所需濃度，得到稀釋菌液；

S4：將所述稀釋菌液以單個液滴的形式分別注入到細(xì)胞培養(yǎng)板的每個微孔中，使每顆液滴中包含一至幾個菌體，得到菌液培養(yǎng)板；所述細(xì)胞培養(yǎng)板的每個微孔中均等量加入含有聯(lián)苯的無機鹽培養(yǎng)基；

S5：將所述菌液培養(yǎng)板恒溫震蕩培養(yǎng)，定期測定每個微孔中的菌量和聯(lián)苯降解中間產(chǎn)物量，并分別繪制每個微孔中菌量和中間產(chǎn)物量隨時間的變化曲線；

S6：吸取菌量或中間產(chǎn)物量變化曲線出峰的微孔中的菌液，將其涂布于噴灑聯(lián)苯的無機鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)形成菌落后鑒定其屬種。

作為優(yōu)選，所述S1中預(yù)處理過程具體如下：

S11：將自然土樣與0.1％的膽酸鈉溶液混合，震蕩搖勻后得到土壤勻漿，將所述土壤勻漿離心并收集上清液；

S12：重復(fù)S11多次，將得到的上清液全部收集后得到預(yù)備菌液；

S13：將所述預(yù)備菌液過孔徑為40μm的細(xì)胞篩以去除雜質(zhì)，離心后棄去上層液體，并加入0.15mol/L的PBS溶液震蕩搖勻；

S14：重復(fù)S13多次，得到初始菌液。