[發明專利]一種生產A82846B的基因工程菌及其制備方法

在審

• 申請號: 202011039882.4
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN114317383A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 胡海峰;田勛
• 申請（專利權）人: 國藥集團健康產業研究院有限公司;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/00;C07K9/00;C12N15/03;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種生產A82846B的基因工程菌，其特征在于，其是在生產A82846B的出發菌荒漠擬孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)的基因組中同源重組整合了人工構建的attB位點，同時整合了內源鹵化酶基因orf10和內源性糖基轉移酶A基因orf11的基因工程菌。

2.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述attB位點是同源重組插入的人工合成的外源基因片段。所述鹵化酶基因orf10和糖基轉移酶基因orf11來源于自身基因。

3.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的鹵化酶基因orf10的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，orf11的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，attB的核苷酸序列如SEQID No.3所示，同源重組質粒pKC1139-attB核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，質粒pSET152-orf10-orf11核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，基因工程菌為荒漠擬孢囊菌SIPI-3927-D20(Kibdelosporangium aridum),保藏于中國微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.19794。

5.一種如權利要求1-4任一項所述基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括下列步驟：1)PCR人工合成attB的全基因；2)構建含attB的同源重組pKC1139-attB質粒，并轉入大腸桿菌DH5α中；3)將帶有重組質粒的大腸桿菌和生產A82846B的出發菌SIPI-3927進行接合培養；4)雙交換篩選獲得新宿主菌SIPI-3927-attB；5)PCR擴增或人工合成orf10、orf11或orf10-orf11的全基因；6)構建orf10、orf11或orf10-orf11的重組pSET152質粒；7)將構建的重組質粒轉化到新宿主菌SIPI-3927-attB；8)將帶有重組質粒的新宿主菌和生產A82846B的出發菌進行接合培養。

6.如權利要求5所述基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述重組質粒的骨架為pKC1139質粒或pSET152；優選地，所述的中間宿主菌為大腸桿菌ET12567/pUZ8002；優選地，所述的接合培養為在MISP4瓊脂培養基培養，溫度為28℃。

7.一種A82846B的制備方法，其特征在于，包括將如權利要求1-4任一項所述的基因工程菌發酵，從發酵液中獲得A82846B。