[發明專利]一種基于多重qPCR技術同時鑒別非洲豬瘟野生毒株和基因缺失株用引物組和試劑盒

在審

• 申請號: 202011037229.4
• 申請日: 2020-09-28
• 公開（公告）號: CN111996191A
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發明（設計）人: 于江;吳家強;孟凱;張玉玉;劉娜;孫文博;陳智;任素芳
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 任霜

本發明提供了一種基于多重qPCR技術同時鑒別非洲豬瘟野生毒株和基因缺失株用引物組和試劑盒，屬于病毒檢測技術領域。基于多重qPCR技術同時鑒別非洲豬瘟野生毒株和基因缺失株用引物探針組，包括p72基因特異引物探針、CD2v基因特異引物探針和MGF基因特異引物探針。試劑盒包括引物探針組。采用試劑盒進行多重qPCR檢測，ASFV的保守基因p72基因特異引物可擴增野生毒株和基因缺失疫苗株，而CD2v基因和MGF基因的特異引物只能擴增野生毒株，三對引物組合使用可實現同時鑒別ASFV野生毒株和基因缺失疫苗株。本發明具有檢測準確、靈敏、高效率、成本低等優點，對臨床樣品的診斷及養殖業有較強的實用價值。

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及一種基于多重qPCR技術同時鑒別非洲豬瘟野生毒株和基因缺失株用引物組和試劑盒。

背景技術

非洲豬瘟(African Swine fever，East African Swine fever，ASF)，是一種急性，發熱傳染性很高的濾過性病毒所引起的豬病，其特征是發病過程短，但死亡率高達100％，病豬臨床表現為發熱，皮膚發紺，淋巴結、腎、胃腸粘膜明顯出血。非洲豬瘟病毒(ASFV)是非洲豬瘟科非洲豬瘟病毒屬的重要成員，病毒粒子的直徑為175-215nm，呈20面體對稱，有囊膜。基因組為雙股線狀DNA，大小170-190kb。目前，根據ASFV的p72基因(B646L)末端核苷酸的差異，可將ASFV分為24個基因型，基于病毒是否會引起紅細胞吸附的特性，已鑒定出至少8個血清群。

ASFV可以通過受體介導的內吞作用或非特異性的巨胞飲作用入侵單核-巨噬細胞系統，通過抑制細胞凋亡、宿主免疫應答等策略逃逸宿主免疫防御系統。由于該病毒基因組巨大，功能性蛋白超過200個。因此，基因缺失疫苗被認為是短期內最有希望開發成功的疫苗，具有同源保護作用，同時也能抵抗異源毒株的攻擊。2020年3月，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所發文稱遴選出一株具有7個基因缺失的病毒HLJ/18-7GD(缺失MGF505-1R，MGF505-2R，MGF505-3R，MGF360-12L，MGF360-13L，MGF360-14L，CD2v)，該缺失株符合弱毒活疫苗安全性標準，可對ASFV強毒株的致死性攻擊提供有效免疫保護。軍事科學院軍事醫學研究院軍事獸醫研究所構建了多基因家族(MGF)和CD2v基因缺失的ASFV基因缺失疫苗候選株，接種豬能夠100％抵抗親本毒株SY18株的攻擊。

目前，鑒定ASFV的方法主要是采用熒光定量PCR技術檢測p72基因，無法區分ASF野毒株和基因缺失疫苗株。一旦確定是ASFV，撲殺焚燒是唯一的處理方法，以免造成更多豬群感染。因此，建立一種能夠快速鑒別ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的診斷方法，是防控ASF的關鍵。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于多重qPCR技術同時鑒別非洲豬瘟野生毒株和基因缺失株用引物組和試劑盒，具有特異性強、準確度高，低成本、靈敏度高、閉管操作安全可靠的特點，為ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的同時快速鑒別檢測及有效防控ASF提供了新的途徑。

本發明提供了一種基于多重qPCR技術同時鑒別非洲豬瘟野生毒株和基因缺失株用引物組，包括ASFV p72基因特異引物、ASFV CD2v基因特異引物和ASFV MGF基因特異引物；

所述ASFV p72基因特異引物包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物p72-F和如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物p72-R；

所述ASFV CD2v基因特異引物包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的正向引物CD2v-F和如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的反向引物CD2v-R；

所述ASFV MGF基因特異引物包括如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的正向引物MGF-F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物MGF-R。

優選的，還包括探針組；