[發明專利]一種多肽修飾氨基酸脫氫酶及其制備和固定化方法

有效

• 申請號: 202011034260.2
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112266905B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 王世珍;王世燕;季哲惠
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N11/089;C07K19/00;C12N15/70;C07K7/06;C12R1/19
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;秦彥蘇

本發明公開了一種多肽修飾氨基酸脫氫酶及其制備和固定化方法。本發明將不同的多肽連接到野生氨基酸脫氫酶的C端或N端末尾，或者取代尾端Loop區，提高氨基酸脫氫酶的界面性能，擴展了氧化還原酶的催化效率，適合于工業化生產，具有重要應用價值。本發明的優點在于思路新穎、工藝簡單、制備條件溫和、實驗與模擬計算相結合。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及氨基酸脫氫酶的界面修飾和生物電催化應用。

背景技術

氨基酸脫氫酶(Amino acid dehydrogenase，AADH)是生物代謝途徑中的重要酶類。氨基酸脫氫酶利用NH₃作為氨基供體催化酮酸不對稱還原胺化反應，可合成系列手性天然氨基酸和結構類似的非天然氨基酸。氨基酸脫氫酶也可制備酶電極用于臨床診斷、食品安全檢測和發酵監控。目前氨基酸脫氫酶的研究主要基于底物結合口袋修飾提高其催化效率、拓展底物譜以及提高其穩定性的報道。

多肽具有來源廣泛、生物兼容性好、易于修飾等特點，且具有良好的力學和電學性能，廣泛應用于生物醫學、臨床檢測、生物催化、物質分離、生物電子器件等領域。利用多肽對氨基酸脫氫酶進行修飾以基于電子傳遞改造并提高其催化效率的研究還未見報道。

發明內容

本發明公開了一種多肽修飾氨基酸脫氫酶及其制備和固定化方法。通過在編碼野生氨基酸脫氫酶基因的基礎上對末端連接不同功能的多肽，提高氨基酸脫氫酶的界面性能，擴展了氨基酸脫氫酶的催化效率，適合于工業化生產，具有重要應用價值。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案之一是：

一種多肽修飾氨基酸脫氫酶的制備方法，將多功能多肽連接到待修飾的氨基酸脫氫酶的N末端或C末端，或將所述多功能多肽取代所述待修飾的氨基酸脫氫酶的尾端Loop區，獲得修飾后的氨基酸脫氫酶；所述多功能多肽包括氨基酸序列如SEQ ID No.7或SEQ IDNo.9所示的多肽。

本發明分別將不同的多肽鏈接到酶的C端或N端末尾，或者取代尾端Loop區，實現與金屬離子配位結合或者與金納米粒子結合提高固定化酶的穩定性。帶His-tag標簽的酶均可采用此方法，不限于苯丙氨酸脫氫酶。

優選地，所述待修飾的氨基酸脫氫酶包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的苯丙氨酸脫氫酶；所述修飾后的氨基酸脫氫酶包括氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示的苯丙氨酸脫氫酶。

具體地，包括以下步驟：

1)多肽連接體制備：選用氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的來自紅球菌(Rhodococcus sp)的苯丙氨酸脫氫酶(PDB:1C1D)作為同源建模的模板，使用The YangZhang Lab開發的I-TASSER(蛋白質結構和功能預測方法)，將多肽接頭連接到苯丙氨酸的N端，進行同源建模。分子圖形軟件PyMOL用于蛋白模型結構的分析與作圖。根據氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的多肽設計核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物，或者根據氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的多肽設計核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14所示的引物；使用所設計的引物對PheDH_1C1D基因進行PCR擴增，獲得含有多肽接頭的PheDH_1D01、PheDH_1D02基因片段，用Nde I和Xho I酶切酶進行雙酶切，回收酶切產物，與同樣雙酶切的pET-28a質粒進行連接，連接產物轉化到大腸桿菌BL21(DE3)的感受態細胞中。實驗采用Takara公司生產的質粒提取和膠回收試劑盒，將連接產物轉化至感受態細胞后，挑取單菌落進行重組菌的鑒定與測序，得到重組表達菌株，并取500μL重組表達菌株添加500μL50％的無菌甘油，混合后保存于-20℃；