[發明專利]逆轉錄病毒載體、應用及CAR-T細胞殺傷功能評估方法

在審

• 申請號: 202011034059.4
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112111522A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 汪晨;張海
• 申請（專利權）人: 南京艾德免疫治療研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N15/23
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 潘云峰

本發明公開了一種逆轉錄病毒載體、應用及CAR?T細胞殺傷功能評估方法，逆轉錄病毒載體包含編碼IFN?γ啟動子和熒光蛋白基因的序列，所述熒光蛋白基因受所述IFN?γ啟動子的轉錄控制；CAR?T細胞殺傷評估方法包括如下步驟：利用逆轉錄病毒載體感染CAR?T細胞；將CAR?T細胞與靶細胞共培養；取共培養后的細胞進行流式細胞分析，檢測熒光蛋白基因表達情況。本發明逆轉錄病毒載體感染宿主CAR?T細胞后，逆轉錄IFN?γ啟動子序列和熒光蛋白基因；宿主CAR?T細胞受到靶細胞刺激時，激活IFN?γ啟動子序列，開始熒光蛋白基因和IFN?γ基因的表達，通過檢測熒光蛋白基因的表達情況能夠分析IFN?γ即γ干擾素的分泌情況；實現快速方便的CAR?T殺傷功能評估方法，普及性強。

技術領域

本發明涉及CAR-T免疫細胞治療技術領域，具體涉及一種逆轉錄病毒載體和應用以及CAR-T細胞放行檢測方法。

背景技術

隨著CAR(chimeric antigen receptor)技術的發展，正成為腫瘤免疫治療的新星技術手段。慢病毒或逆轉錄病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的基因治療效果。目前慢病毒載體與逆轉錄病毒載體被廣泛用于CAR-T免疫細胞治療領域。

在CAR-T研究中，常常需要對某種CAR-T進行體外細胞水平和體內小鼠腫瘤模型的功能驗證。對CAR-T殺傷功能評估的重要指標之一就是IFN-γ的分泌水平；同時在臨床研究中，由于在靶細胞刺激下會促進CAR-T細胞分泌IFN-γ，因此通常CAR-T產品的放行指標之一就是腫瘤抗原刺激下IFN-γ的分泌水平。

目前通常使用Elisa試劑盒進行細胞因子的檢測，但是Elisa檢測耗費時間長，成本高，操作也較繁瑣，不利于CAR-T細胞的快速放行檢測。

因此急需一種快速方便的檢測受腫瘤抗原刺激后CAR-T細胞分泌IFN-γ情況的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種逆轉錄病毒載體和應用以及CAR-T細胞放行檢測方法，以解決現有技術中采用Elisa試劑盒進行細胞因子的檢測，檢測耗費時間長，成本高，操作也較繁瑣，不利于CAR-T細胞的快速放行檢測的技術問題。

為了實現上述目的，本發明的技術方案是：

本發明第一方面公開了一種逆轉錄病毒載體，包含編碼IFN-γ啟動子和熒光蛋白基因的序列，所述熒光蛋白基因受所述IFN-γ啟動子的轉錄控制。

通過采用上述方案，本發明的逆轉錄病毒載體感染宿主CAR-T細胞后，能夠逆轉錄IFN-γ啟動子序列和熒光蛋白基因；當宿主CAR-T細胞受到靶細胞刺激時，會同時激活逆轉錄的IFN-γ啟動子序列以及宿主DNA中的IFN-γ啟動子序列，從而開始熒光蛋白基因和IFN-γ基因的表達，通過檢測熒光蛋白基因的表達情況能夠分析IFN-γ即γ干擾素的分泌情況，從而對CAR-T殺傷功能進行評估。

在本發明的某一個實施例中，所述IFN-γ啟動子序列為SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示序列中的一種。

在本發明的某一個實施例中，所述熒光蛋白基因為GFP、EGFP、RFP、mcherry中的一種或多種組合。

在本發明的某一個實施例中，所述逆轉錄病毒載體不包含增強子。

通過采用上述方案，避免增強子增強熒光蛋白基因表達，從而影響對于熒光蛋白基因的表達情況與IFN-γ基因表達情況的相關性，影響分析結果。

在本發明的某一個實施例中，所述逆轉錄病毒為慢病毒。

本發明第二方面公開了包括上述逆轉錄病毒載體的CAR-T細胞。