[發(fā)明專利]調(diào)控棉花對黃萎病和干旱抗性的轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY1-like基因及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011029736.3
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112322628B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡琴;張獻龍;朱龍付;杜雪竹;盛鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/60;A01H6/20
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及調(diào)控棉花對黃萎病和干旱抗性的轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY1?like基因及應(yīng)用。對陸地棉接種黃萎病菌后不同時間點RAN?Seq數(shù)據(jù)進行分析，篩選得到受黃萎病誘導(dǎo)表達的轉(zhuǎn)錄因子基因GhWRKY1?like，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO:2所示。利用VIGS體系，在棉花中沉默GhWRKY1?like后接種黃萎病菌，快速證實該基因?qū)γ藁S萎病抗性具有正向調(diào)控作用。利用GhWRKY1?like超量表達的棉花和擬南芥材料，進一步驗證該基因在黃萎病和干旱抗性中的正向調(diào)控功能，即超量表達該基因能夠顯著提高植物對黃萎病菌和干旱的抗性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一個調(diào)控棉花對黃萎病和對干旱抗性的轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY1-like基因及應(yīng)用。對陸地棉YZ1接種黃萎病(Verticilliumdahliae)V991后不同時間點RAN-Seq數(shù)據(jù)進行分析，篩選到了一系列受黃萎病誘導(dǎo)表達的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。通過VIGS體系，在棉花中沉默相應(yīng)的基因，進一步接種黃萎病菌，快速鑒定其在棉花黃萎病抗性中的功能。其中，鑒定到的GhWRKY1-like基因能夠正調(diào)控棉花對黃萎病的抗性，即沉默該基因，能夠顯著提高棉花對黃萎病菌的抗性。在棉花和擬南芥中超量表達該基因，轉(zhuǎn)基因材料能明顯提高棉花和擬南芥對黃萎病菌以及對干旱的抗性。

背景技術(shù)

隨著農(nóng)業(yè)環(huán)境的日益惡化，黃萎病等生物逆境的發(fā)生連年加重，嚴(yán)重制約了棉花的可持續(xù)發(fā)展。黃萎病素有棉花“癌癥”之稱，嚴(yán)重危害棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)。近些年，黃萎病連年發(fā)生，對我國棉花生產(chǎn)常年造成減產(chǎn)10-20％，部分地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重時高達70％，已成為制約我國棉花高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙之一。研究表明陸地棉對黃萎病的抗性基本表現(xiàn)為感病或耐病，其攜帶有的抗病位點也多是微效多基因位點，且受環(huán)境影響大，難以進行聚合，因此生產(chǎn)上還沒有高抗棉花黃萎病的品種大面積推廣應(yīng)用(王升正等，抗黃萎病新品系中植棉KV-3抗性遺傳特性研究.棉花學(xué)報,2010，22(5):501-504)。隨著淡水資源的日益缺乏，干旱等極端自然環(huán)境的頻繁發(fā)生，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對農(nóng)作物耐旱性需求日益明顯。而我國現(xiàn)有的棉花抗旱種質(zhì)資源比較狹窄，多年來，人們采用傳統(tǒng)選育方法解決棉花品種的抗旱問題，但往往耗資大、周期長，而且選擇效率不高。因此，進一步提高棉花的綜合抗性(抗黃萎病和抗旱)能力，對棉花綠色可持續(xù)生產(chǎn)有著重要的意義。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在其氨基酸序列的N端一般都有保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，起到DNA綁定的作用，C端一般含有非典型的親水鋅指結(jié)構(gòu)域。研究表明，WRKY類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長發(fā)育的各個方面，比如對生物逆境和非生物逆境的響應(yīng)、葉片的衰老、種子休眠、花藥發(fā)育、表皮毛發(fā)生以及開花調(diào)控等。此外，許多WRKY類轉(zhuǎn)錄因子還表現(xiàn)出多效性。大麥HvWRKY1不僅參與對冷害、干旱的響應(yīng)，同時還能調(diào)控種子休眠以及對病原菌的免疫反應(yīng)；水稻OsWRKY13參與對干旱脅迫和病原菌的響應(yīng)；棉花GbWRKY1參與對黃萎病的防御反應(yīng)以及開花期調(diào)控。由此可見，WRKY類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物對生物和非生物逆境脅迫響應(yīng)中扮演著重要的角色。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技術(shù)近年來發(fā)展迅速，其優(yōu)勢在于操作簡單，且可以同時操作多個基因，越來越多的研究者利用該體系來快速鑒定基因的功能。本發(fā)明提出之前，申請人通過對陸地棉YZ1接種黃萎病(Verticilliumdahliae)V991病菌后對不同時間點RAN-Seq數(shù)據(jù)進行分析，篩選到了一系列受黃萎病誘導(dǎo)表達的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。通過VIGS體系鑒定得到GhWRKY1-like基因，發(fā)現(xiàn)該基因正調(diào)控棉花對黃萎病的抗性；沉默該基因，能夠顯著提高棉花對黃萎病菌的抗性。本發(fā)明又發(fā)現(xiàn)在棉花和擬南芥中超量表達GhWRKY1-like基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料能明顯提高棉花和擬南芥對黃萎病菌以及對干旱的抗性。該研究為利用基因工程提高棉花的綜合抗性能力提供了理論基礎(chǔ)和及基因資源。

發(fā)明內(nèi)容