[發明專利]一種新型β-木糖苷酶及其制備

有效

• 申請號: 202011029392.6
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112111472B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 劉逸寒;王鳳華;葛秀琪;路福平
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/75;C12N1/21;C12Q1/34;C12R1/125;C12R1/10;C12R1/07
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及一種酶活力提高的β?木糖苷酶突變體及其制備。本發明通過分子生物學技術手段獲得短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)野生型的β?木糖苷酶基因，利用易錯PCR技術對野生型β?木糖苷酶基因進行隨機突變，得到β?木糖苷酶突變體E455G，及其編碼基因xylm，重新構建重組質粒，并實現了其在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌中的高效表達，通過發酵、提取等技術獲得高活力的β?木糖苷酶。

技術領域：

本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及通過易錯PCR技術體外定向進化獲得酶活力提高的β-木糖苷酶突變體及其制備。

背景技術：

β-木糖苷酶(β-xylosidase,XYL,EC 3.2.1.37)是木聚糖降解酶系的重要組成部分，以外切的方式水解低聚寡糖和木糖苷底物的非還原性末端殘基，生成木糖，通過與木聚糖酶協同作用，已在多個領域中具有廣泛應用。在食品應用方面，木聚糖酶和β-木糖苷酶的添加，可使長鏈的阿拉伯木聚糖分解成短鏈，降低啤酒的粘度。在面包生產過程中適量的添加一些β-木糖苷酶可使面包的機械性能，質地等方面得到很大的改善；在能源應用方面，自然界中的木聚糖含量豐富，可利用木聚糖酶系將其水解生成木寡糖和木糖，進而利用釀酒酵母等菌株發酵生成生物質乙醇等能源；在環境保護方面，β-木糖苷酶可使一些農業及工業等生產過程中產生的垃圾及廢棄物降解，從而有效的改善環境，同時β-木糖苷酶的使用減少了許多有害的有機或者無機化學試劑的應用，這樣就更有利于實現環境社會的可持續發展的目標；在飼料生產方面，β-木糖苷酶作為飼料添加劑，能夠使其中所含的的木聚糖部分水解，從而使與其相連的纖維素等更容易被瘤胃消化，達到改善飼料營養價值的目的。

根據氨基酸序列的相似性，β-木糖苷酶分為多個糖苷水解酶(GH)家族，包括GH1、GH2、GH3、GH5、GH30、GH39、GH43、GH52、GH54、GH120，這與木聚糖的異質性相適應，而目前已報道的β-木糖苷酶大部分存在于GH3、GH39和GH43中。β-木糖苷酶的來源較廣泛，于細菌、放線菌、古細菌、真菌(包括酵母)等微生物以及小麥等高等植物中均有發現，目前研究較多的是來自于細菌和真菌的β-木糖苷酶。其中，β-木糖苷酶的分子量從26kDa到400kDa之間不等，產生的酶蛋白有單體、二聚體、三聚體和四聚體等。據報道，大多數的細菌和酵母中的β-木糖苷酶為胞內酶，而一些真菌中的β-木糖苷酶則為胞外酶。

酶分子體外定向進化屬于蛋白質的非理性進化，是改善蛋白質功能和活性的重要手段之一，屬于蛋白質工程的范疇。在事先不了解蛋白質的高級結構以及催化位點等因素的情況下，可以人為創造條件模擬自然選擇的進化機制，通過分子生物學手段在體外快速建立含大量目的蛋白編碼基因的突變體文庫，并通過高通量的定向篩選方法，快速得到符合某些預期效果的蛋白突變體。定向進化的核心步驟主要包括構建具有多樣性的突變體文庫和高通量的篩選方法。常用的包括：易錯PCR、飽和突變、DNA改組、交錯延伸PCR等。與之不同，當已知蛋白質的空間結構、活性位點、催化機制等因素時，在此基礎上有的放矢對基因進行改造的是定點突變，即理性設計。因它只能對天然酶蛋白質中的少數氨基酸進行替換、刪除或插入，對酶功能的改造有限。因此，對于結構與功能未知的酶，定向進化可在一定程度上彌補理性設計的不足。

芽孢桿菌表達系統作為一種安全、高效、多功能和極具開發潛力的微生物菌種已廣泛地應用于工業、農業、醫藥、衛生、食品、畜牧業、水產及科研領域。它與常用的大腸桿菌表達系統相比有著獨特的優勢，即可將目的基因表達的產物分泌到胞外，從而降低進一步收集、分離、純化基因表達產物的成本和工作量。芽孢桿菌中枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等均可作為表達宿主菌。在微生物遺傳學領域，芽孢桿菌屬背景研究也十分清楚，具有密碼子偏愛性不明顯、發酵簡單、生長迅速、不產生致病毒素、對培養基無特殊要求等優點。隨著分子生物學技術的發展和芽孢桿菌研究的深入，使用芽孢桿菌表達系統已經克隆和表達了大量基因，有些已進行大規模工業生產，多種酶和臨床需要的化學藥品或者工業產品都通過芽孢桿菌來表達生產。