[發明專利]一種體外人工類反射弧結構及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202011029044.9
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112111455B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 石青;陳喆;梁倩;孫韜;王化平;黃強;福田敏男
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12Q1/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種體外人工類反射弧結構的構建方法，包括以下步驟：

（1）在基底表面直流磁控濺射形成氮化鉻薄膜，在所述氮化鉻薄膜表面形成光刻膠層，得到勻膠鉻版；

對所述勻膠鉻版的光刻膠層依次進行激光直寫和顯影，生成單向閾門單元微蛋白掩模圖案，得到母版；所述單向閾門單元微蛋白掩模圖案包括順次連接的傳入神經群生長部分、軸突伸展連接部分和傳出神經群生長部分；所述軸突伸展連接部分與所述傳入神經群生長部分的連接處較粗，所述軸突伸展連接部分與所述傳出神經群生長部分的連接處較細，以此約束軸突的伸張方向；所述傳出神經群生長部分由于軸突伸展連接部分的結構約束，缺乏投射至傳入神經群的軸突，傳出神經群的神經活動不會傳入傳入神經群，以上結構構成了所述單向閾門單元；

（2）在所述步驟（1）得到的母版有圖案一面加入包含硅橡膠預聚物和固化劑的混合物，進行固化，得到硅橡膠微印刷版；

（3）將多電極陣列培養皿進行等離子處理后加入瓊脂糖水溶液進行表面改性，得到改性多電極陣列培養皿；

（4）通過微型機械臂將所述步驟（2）得到的硅橡膠微印刷版置于粘性蛋白液中浸泡后取出，微接觸印刷于所述步驟（3）得到的改性多電極陣列培養皿的表面，得到含微蛋白圖案的改性多電極陣列培養皿；

（5）在所述步驟（4）得到的含微蛋白圖案的改性多電極陣列培養皿中加入感覺神經元懸浮液和神經基礎培養液，進行培養，得到體外人工類反射弧結構；

所述步驟（1）與步驟（3）、步驟（2）與步驟（3）之間沒有時間順序限制。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（1）中，所述氮化鉻薄膜的厚度為90~110nm；

所述光刻膠層的厚度為10~15μm。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（1）中，所述激光直寫的條件包括：激光占空比為20~50%，激光功率為5~30mW。

4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（2）中，所述硅橡膠預聚物和固化劑的質量比為（5~15）：1；

所述固化的溫度為50~70℃，時間為2~5h。

5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（3）中，所述瓊脂糖水溶液的濃度為0.1~0.5w/v%。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（4）中，所述粘性蛋白液包括ECM凝膠、纖連蛋白、聚賴氨酸和漢克平衡鹽緩沖溶液；所述粘性蛋白液中，ECM凝膠的濃度為1.5~2.5wt%，纖連蛋白的濃度為8~12μg/mL，聚賴氨酸的濃度為45~55μg/mL。

7.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（4）中，所述微接觸印刷的壓力為450~550g，時間為15~25min。

8.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（5）中，所述感覺神經元懸浮液的濃度為（5~50）×10⁴個/mL；

所述培養的時間為5~7天。

9.權利要求1~8任一項所述構建方法得到的體外人工類反射弧結構作為反射弧形成過程研究、藥理測試或電生理測試用體外模型的應用。