[發(fā)明專利]一株高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011026544.7
• 申請(qǐng)日: 2020-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112126611B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉開(kāi)泉;李玲;王瑞明;王騰飛;李丕武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/78;C12P17/12;C12R1/38
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

1.一株產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，其特征在于，具體是敲除綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）Qlu-1基因組中的phzO基因、lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因、rpeA基因和pykF基因中的一個(gè)或多個(gè)即得；

其中，所述綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）Qlu-1已送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2020年05月08日，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2020108。

2.如權(quán)利要求1所述的一株產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，其特征在于，所述phzO基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的堿基序列分別如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

所述pykF基因的堿基序列如SEQ ID NO.7所示。

3.如權(quán)利要求2所述的一株產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，其特征在于，所述產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株具體是敲除綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）Qlu-1基因組中的phzO基因、lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因、rpeA基因和pykF基因即得。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

敲除綠針假單胞菌Qlu-1基因組中的phzO基因、lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一個(gè)或多個(gè)。

5.如權(quán)利要求4所述的產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述敲除phzO基因步驟包括：

i、擴(kuò)增phzO基因片段的上下游同源臂；采用融合PCR法連接上下游同源臂并插入pK18mobsacB質(zhì)粒中得phzO基因重組質(zhì)粒；

ii、將phzO基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌S17-1(λ)后與綠針假單胞菌Qlu-1進(jìn)行雙親雜交培養(yǎng)，從而將phzO基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入綠針假單胞菌Qlu-1；

iii、篩選陽(yáng)性克隆，即得菌株QPCA-1。

6.如權(quán)利要求5所述的產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，擴(kuò)增phzO基因片段上游同源臂的引物包括PhzO-F1和PhzO-R1，序列分別如SEQ ID NO.8和SEQID NO.9所示；

擴(kuò)增phzO基因片段下游同源臂的引物包括PhzO-F2和PhzO-R2，序列分別如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示；

采用融合PCR法連接上下游同源臂獲得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.12所示。

7.如權(quán)利要求5所述的產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，篩選陽(yáng)性克隆的方法具體包括蔗糖平板篩選、影印篩選和PCR篩選。