[發明專利]一段來源于鴨疫里氏桿菌RA-YM株的基因在作為鴨疫里氏桿菌整合酶中的應用

在審

• 申請號: 202011025898.X
• 申請日: 2020-09-25
• 公開（公告）號: CN112391359A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 李自力;王穎;張陽;周祖濤;胡思順
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于動物細菌基因工程技術領域，公開了一段來源于鴨疫里氏桿菌RA?YM株的基因在作為鴨疫里氏桿菌整合酶中的應用，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白為SEQ ID NO.2所示。該整合酶能位點特異性整合至鴨疫里氏桿菌特定位點，表達外源蛋白后，能連續傳代仍具有穩定性。本發明所得的該整合酶及整合位點能在鴨疫里氏桿菌中穩定存在，并能介導外源基因的表達，其操作方法簡單，穩定性高。

技術領域

本發明屬于動物細菌基因工程技術領域，具體涉及一段來源于鴨疫里氏桿菌RA-YM株的基因在作為鴨疫里氏桿菌整合酶中的應用。

背景技術

整合酶在微生物、細胞、植物和動物的基因表達中均起著重要作用。C.Ljungdahlii的噬菌體整合酶介導的大片段DNA穩定整合染色體。最近的一項研究表明BxB1整合酶系統引導假單胞菌穩定的外源基因表達。λ整合酶介導了用于治療性蛋白質表達的無縫克隆載體轉基因平臺的建立。此外，利用phiC31噬菌體整合酶構建了脂質體轉化的新方法。Cre/lox介導的基因組修飾已廣泛應用于小鼠功能基因組學研究。

λ噬菌體的發現是酪氨酸位點特異性重組酶(T-SSR)研究的起點。λ整合酶(λInt)是大腸桿菌λ噬菌體中的一種蛋白質，用于將λ噬菌體基因組整合并從大腸桿菌染色體中切除。在λ噬菌體中，λ整合酶能催化attP和attB位點的整合，形成attL和attR位點。除整合酶外，整合和外切反應還需要宿主因子的整合，而切除則需要一種外切酶。T-SSR是一種DN A修飾酶，具有識別目標位點、結合、切割、鏈交換和鏈重新連接等功能。Int成為T-SSRs的家族成員，它在attB和attP連接位點之間重組。除了整合酶，一些重組酶還需要與宿主因子結合。T-SSRs-Cre和Flp是分子生物學研究中廣泛應用的工具酶。

已報道的鴨疫里氏桿菌穿梭質粒復制元件復制子起源于鴨疫里氏桿菌內源性質粒，質粒復制具有不可控性，因此很難保證目的基因的穩定表達。已報道的鴨疫里氏桿菌整合酶不僅僅具有整合功能，而且具有外切功能，具有可移動性。雖然該整合酶介導的外源基因能穩定表達，但仍然存在不穩定性。

針對上述在鴨疫里氏桿菌中表達異源基因的問題。本申請提供的整合酶僅具有整合功能，不具有外切功能，可用于在鴨疫里氏桿菌中穩定表達外源抗原，為互補菌株的構建及以鴨疫里氏桿菌弱毒株為載體表達外源抗原的基因工程活疫苗研制提供了新思路。

發明內容

本發明的目的在于提供一段來源于鴨疫里氏桿菌RA-YM株的核苷酸序列在作為鴨疫里氏桿菌整合酶中的應用，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白為SEQ ID NO.2所示。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

申請人自鴨疫里氏桿菌RA-YM株中發現了一段基因序列具備整合酶作用，該基因可將外源基因整合至鴨疫里氏桿菌中穩定表達，實現了鴨疫里氏桿菌中穩定表達外源抗原的目的。所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白為SEQ ID NO.2所示。

本發明提供的序列可用于構建鴨疫里氏桿菌重組菌株，用于鴨疫里氏桿菌外源蛋白的表達；或是用于鴨疫里氏桿菌基因缺失株和互補菌株的研究；在應用時所述的鴨疫里氏桿菌的基因組中不含有SEQ ID NO.1所示序列且包含附著位點attB序列。

以上所述的應用中，在制備重組菌株時，可通過構建重組整合自殺質粒，利用接合轉移方法構建鴨疫里氏桿菌重組整合菌株。

與現有技術相比，本發明具有以下突出優點：

申請人首次發現來源于鴨疫里氏桿菌RA-YM的核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)整合功能，該基因能介導質粒在鴨疫里氏桿菌中的整合與外源基因的穩定表達，該基因僅有整合功能，無外切功能，可保證外源基因的穩定表達。本發明為進一步研制以鴨疫里氏桿菌弱毒菌株為載體表達其他病原抗原的基因工程活疫苗奠定基礎。