[發明專利]一種與非梗阻性無精子癥診斷相關的血漿外泌體tsRNA標志物及其應用

有效

• 申請號: 202011023344.6
• 申請日: 2020-09-25
• 公開（公告）號: CN112176052B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 朱作斌;李穎;韓從輝
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/113;C12N15/11
• 代理公司: 北京淮海知識產權代理事務所(普通合伙) 32205
• 代理人: 李妮

本發明公開了一種與非梗阻性無精子癥診斷相關的血漿外泌體tsRNA標志物及其應用。該標志物為tRF?Gly?GCC?002，tRF?Gly?GCC?002的序列為SEQ ID NO.1。該標志物對非梗阻性無精子癥具有特異性和靈敏性，可用于制備非梗阻性無精子癥的診斷試劑盒。本發明的血漿外泌體標志物tRF?Gly?GCC?002在非梗阻性無精子癥和梗阻性無精子癥患者血漿中差異表達，其能夠較好地診斷非梗阻性無精子癥，并能夠預測無精子癥取精結果，其效果優于常用的血漿卵泡刺激素水平及睪丸體積等指標。

技術領域

本發明屬于生物診斷和醫藥領域，具體涉及一種與非梗阻性無精子癥診斷相關的血漿外泌體tsRNA標志物及其應用。

背景技術

無精子癥的發生率占男性不育癥的10％-20％。根據睪丸中有無精子可分為兩類：一類是睪丸具有正常精子發生的阻塞性無精子癥（obstructive azoospermia, OA）。另一類是睪丸精子發生障礙的非阻塞性無精子癥（non-obstructive azoospermia, NOA）。對非阻塞性無精癥的準確診斷可以為臨床醫生提供有價值的指導。盡管精液中的常規生化標志物，例如檸檬酸，酸性磷酸酶，果糖和α-葡萄糖苷酶等可用于輔助診斷OA患者；睪丸體積，血清卵泡刺激素（FSH）水平等可輔助診斷NOA患者，但是仍有一部分患者無法利用這些指標進行正確的診斷。

睪丸活檢的病理診斷是確定睪丸精子發生狀態的“金標準”。然而，侵入性手術不僅給患者帶來痛苦，而且還可能引起生精管的進行性和不可逆轉的破壞。睪丸穿刺取精進行輔助生殖是治療無精子癥患者的重要手段，然而睪丸穿刺取精成功率并不高，通過準確、無創的術前評估對提高睪丸穿刺取精成功率具有重要意義。本專利旨在鑒定可以準確評估睪丸精子提取成功率的生物標志物。外泌體是大多數細胞分泌的細胞外囊泡，直徑為30-150nm，具有脂質雙層膜結構。非阻塞性無精子癥患者睪丸不能產生精子，其組織結構與能夠產生精子的阻塞性無精子癥患者的睪丸組織顯著不同。因此，NOA患者和OA患者產生的血漿中的外泌體也不同。因此，血漿外泌體是區分睪丸病理和生理狀況的潛在生物標記物的重要來源。

近年來，人們發現一種新型的調控性小非編碼RNA，稱為tRNA衍生的小RNA（tRNA-derived small RNA, tsRNA），在人體液中富集。tsRNA是通過對tRNA及其前體進行精確調控而產生的片段。據報道， tsRNA的組成和數量高度依賴于特定的細胞類型和病理狀況，使其成為一類出色的生物標志物。最近的研究發現，tsRNA在睪丸和精子細胞中表達。由于tsRNA在哺乳動物的精子成熟和受精中起著重要作用，并且它們在血漿和外泌體中的富集程度高于miRNA，這表明tsRNA可以用作NOA診斷的有前途的生物標記。

發明內容

本發明的目的之一在于克服已有無創診斷指標不能有效診斷非梗阻行無精子癥的不足，提供一種與非梗阻性無精子癥診斷相關的血漿外泌體tsRNA標志物。

本發明的目的之二在于提供上述血漿外泌體tsRNA標志物的特異性引物。

本發明的目的之三在于提供一種含有上述血漿外泌體tsRNA標志物的特異性引物的非梗阻性無精子癥診斷試劑盒。

為實現上述目的，本發明提供一種與非梗阻性無精子癥診斷相關的血漿外泌體tsRNA標志物，該標志物為tRF-Gly-GCC-002，tRF-Gly-GCC-002的序列為：GCATAGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTT（SEQ ID NO.1）。

血漿外泌體tsRNA標志物tRF-Gly-GCC-002的特異性引物的序列為：

F:5’ GATCGCATAGGTGGTTCAGTG3’（SEQ ID NO.3）；

R:5’ GTGTGCTCTTCCGATCTAAGAAT3’（SEQ ID NO.4）。