[發(fā)明專利]一種PD-L1免疫組織化學(xué)參考品及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011018712.8
• 申請(qǐng)日: 2020-09-24
• 公開（公告）號(hào): CN111929447B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋良慎;邱凱;史鵬燕;劉楚新;明炳玉;高攀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 菁良基因科技（深圳）有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/574;C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;G01N33/531;G01N1/36;G01N1/30
• 代理公司: 深圳智趣知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44486
• 代理人: 王策

本發(fā)明公開了一種PD?L1免疫組織化學(xué)參考品及其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)同源重組的方式將PD?L1的cDNA序列敲入細(xì)胞系，獲得單克隆細(xì)胞系，通過(guò)qRT?PCR和免疫組織化學(xué)染色，確定單克隆細(xì)胞系的PD?L1表達(dá)強(qiáng)度；將PD?L1免疫組織化學(xué)無(wú)染色、弱染色、中等染色及強(qiáng)染色的單克隆細(xì)胞系切片中的任意一種或多種排列在一張載玻片上，作為PD?L1免疫組織化學(xué)染色的參考品。本發(fā)明的參考品，可作為PD?L1免疫組織化學(xué)的良好外部對(duì)照，監(jiān)控整個(gè)PD?L1免疫組織化學(xué)流程的有效性，為PD?L1表達(dá)的檢測(cè)提供高靈敏度和高特異性的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種PD-L1免疫組織化學(xué)參考品及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

程序性死亡配體-1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）是B7超家族成員，屬于I型跨膜蛋白，在人類中由CD274基因編碼。PD-L1在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞表面表達(dá)，在癌組織中也廣泛表達(dá)，如肺癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、腎癌、腸癌、食道癌、胰腺癌等。PD-L1與T細(xì)胞表面的受體PD-1結(jié)合，發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，抑制T細(xì)胞的激活、分化和增殖，使得腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞殺傷，獲得免疫逃逸。

近年來(lái)腫瘤免疫治療取得飛速發(fā)展，以抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑成為臨床研究的熱點(diǎn)。截至2020年3月，中國(guó)已上市4款進(jìn)口PD-1/PD-L1單抗藥物，4款國(guó)產(chǎn)PD-1單抗藥物，如納武利尤單抗（Nivolumab）、帕博利珠單抗（Pembrolizumab）、特瑞普利單抗（Toripalimab）、信迪利單抗（Sintilimab）、卡瑞利珠單抗（Camrelizumab）、度伐利尤單抗（Durvalumab）、替雷利珠單抗（Tislelizumab）和阿替利珠單抗（Atezolizumab）。抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體藥物的上市必然伴隨檢測(cè)試劑的出現(xiàn)。目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)的與抗 PD-1抗體或抗PD-L1抗體藥物配套使用的試劑均為針對(duì)PD-L1蛋白的抗體檢測(cè)試劑。檢測(cè)方法都是對(duì)石蠟包埋的組織（FFPE）樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。目前用于PD-L1識(shí)別的單克隆抗體克隆號(hào)有28-8、22C3 、SP263和SP142。有報(bào)告指出其中的28-8、22C3、SP263克隆號(hào)抗體檢測(cè)的一致性較高。

由于PD-L1的檢測(cè)結(jié)果對(duì)于患者的用藥具有重要的指導(dǎo)作用，為提高用藥的有效性，準(zhǔn)確的PD-L1免疫組織化學(xué)檢測(cè)至關(guān)重要。隨著抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體藥物研究的發(fā)展，相應(yīng)的檢測(cè)需求也日趨增多，除了商業(yè)化的檢測(cè)試劑盒，也有很多實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)方法（Laboratory Developed Tests，LDT）的需求，可以預(yù)見更多新的PD-L1檢測(cè)試劑也會(huì)應(yīng)運(yùn)而生。

影響免疫組織化學(xué)結(jié)果的因素眾多，比如抗原修復(fù)條件、抗體使用、顯色反應(yīng)條件、操作一致性等諸多因素，上述因素的細(xì)微改變就會(huì)影響最終的結(jié)果，因此，免疫組織化學(xué)的過(guò)程質(zhì)控顯得尤為重要。目前還少有PD-L1的免疫組織化學(xué)參考品，有報(bào)道用不同的人體組織樣本進(jìn)行切片作為PD-L1表達(dá)的測(cè)試片，但是存在比較明顯的缺陷和不足：1、樣本來(lái)源于數(shù)量有限的人體組織，屬于一次性材料，無(wú)法長(zhǎng)期穩(wěn)定的用于參考品生產(chǎn)；2、使用不同的人體組織樣本（如扁桃體組織和癌癥組織），存在組織異質(zhì)性和不可重復(fù)性，不能很好的確保參考品的均勻性和一致性，無(wú)法穩(wěn)定的提供明確的PD-L1表達(dá)強(qiáng)度的對(duì)照。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提出了一種PD-L1免疫組織化學(xué)參考品及其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)同源重組的方式將PD-L1的cDNA序列敲入細(xì)胞系，獲得單克隆細(xì)胞系，通過(guò)qRT-PCR和免疫組織化學(xué)染色，確定所述單克隆細(xì)胞系的PD-L1表達(dá)強(qiáng)度；將PD-L1免疫組織化學(xué)無(wú)染色、弱染色、中等染色及強(qiáng)染色的單克隆細(xì)胞系切片排列在一張載玻片上，作為PD-L1免疫組織化學(xué)染色的參考品。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案：

一種PD-L1免疫組織化學(xué)參考品，包含以下成份：