[發明專利]利用雙標記探針的檢測信號增強的核糖核酸檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202011014869.3
• 申請日: 2020-09-24
• 公開（公告）號: CN112626178A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 宋太陽
• 申請（專利權）人: 首琳生物科學株式會社
• 主分類號: C12Q1/6818
• 分類號: C12Q1/6818
• 代理公司: 北京鍾維聯合知識產權代理有限公司 11579
• 代理人: 羅銀燕

本發明提供如下的核糖核酸檢測方法及試劑盒，即，在沒有擴增靶核糖核酸的情況下，增強雙標記的探針的檢測信號，從而能夠確定試樣中微量存在的靶核糖核酸的存在與否并進行定量分析，上述雙標記的探針當不與靶核糖核酸互補性結合時不產生檢測信號，但當與靶核糖核酸互補性結合時產生檢測信號。根據本發明，能夠進行fM濃度范圍為止的核糖核酸的檢測，在利用表示關于核糖核酸濃度的熒光信號值的標準曲線的情況下，可以通過檢測熒光信號值來計算核糖核酸濃度，因此能夠確定試樣中微量存在的靶核糖核酸的存在與否并進行定量分析。而且，本發明在檢測靶核糖核酸時可以實時通過數值確認檢測結果。

技術領域

本發明涉及利用雙標記探針的增強檢測信號的核糖核酸(RNA)檢測方法及試劑盒，更詳細地，涉及如下的方法及試劑盒，即，增強從與作為檢測對象的靶核糖核酸互補性結合的雙標記的探針產生的檢測信號，在沒有擴增靶核糖核酸的情況下，迅速簡便且特異度及敏感度高地檢測靶核糖核酸。

并且，本發明涉及如下的核糖核酸檢測方法及試劑盒，即，在沒有擴增靶核糖核酸的情況下，增強雙標記的探針的檢測信號，從而能夠確定試樣中微量存在的靶核糖核酸的存在與否并進行定量分析，上述雙標記的探針當不與靶核糖核酸互補性結合時不產生檢測信號，但當與靶核糖核酸互補性結合產生檢測信號。

而且，本發明涉及如下的多元方式的核糖核酸檢測方法及試劑盒，即，將由產生互不相同波長的光的熒光物質和消光物質標記的多個探針與多個靶核糖核酸分別對應，通過增強從各個探針的互不相同波長的熒光信號來檢測，從而可以同時檢測所有多個靶核糖核酸。

背景技術

微核糖核酸(microRNA或miRNA)于1990年首次報告，直到2000年代初，其功能尚不明確，但是，最近發現人類基因組中編碼(encoding)有約2500個微核糖核酸。微核糖核酸調節全部基因的60％至70％，并且，眾所周知，按組織、按細胞以及按特定時期表現出表達差異的微核糖核酸同時多發性地調節多種基因。

已發現由于微核糖核酸的基因突變等引起的功能不協調，可能發生包括癌癥在內的多種疾病，因此，進行將微核糖核酸活用作治療用靶的研究。而且，已發現微核糖核酸在血液中以高濃度循環，因此還可以活用作診斷用靶。

但是，微核糖核酸的尺寸非常小(～22nt)，以比信使核糖核酸更加易于分解而周知，因此，將難以分離或檢測其。并且，由于微核糖核酸與疾病的發生相關作用被周知，而關注將其用于診斷及治療的可能性，但由于其與誘發疾病的相關性及準確率低，尚未應用于早期診斷/預測醫療的技術開發中。因此，波切需要開發將微核糖核酸用作生物標記物來診斷的新型分析方法及診斷技術。

常規且普遍化的代表性微核糖核酸分析技術已知有northern印跡雜交(NorthernBlot)分析和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR，quantitative reversetranscription-PCR)，但各分析方法均具有技術局限。northern印跡雜交方式可以通過條帶的大小對微核糖核酸進行部分定量，但具有需消耗2天至3天的漫長分析時間和使用放射性同位素的問題，因此只能局限在實驗室水平下進行。

到現在為止，通常將實時熒光定量聚合酶鏈式反應用作能夠定量分析微核糖核酸的技術，但具有預處理過程復雜且分析時間長的缺點，因此以分析為目的使用時具有局限性。并且，需要昂貴的實時聚合酶鏈式反應設備，所生成的聚合酶鏈式反應產物大小相似，因此具有同時檢測多種微核糖核酸的多元分析受限的缺點。即，實時熒光定量聚合酶鏈式反應具有復雜的執行步驟引起的錯誤和在經濟上費用高等的缺點。