[發明專利]一種檢測極端嗜鹽生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系統及方法

在審

• 申請號: 202011014249.X
• 申請日: 2020-09-24
• 公開（公告）號: CN114250243A
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 付憲;張浩霖;沈玥
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/65;C12Q1/25;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 何葉喧

1.一種檢測翻譯工具是否具有合成非天然氨基酸的蛋白質的活性的方法；

所述翻譯工具為待測氨酰-tRNA合成酶和待測tRNA；

所述方法包括如下步驟：

(1)制備具有功能元件表達框的重組表達載體；功能元件表達框包括如下元件：報告蛋白的編碼基因、待測氨酰-tRNA合成酶的編碼基因、待測tRNA的編碼基因；功能元件表達框中，報告蛋白的編碼基因和待測氨酰-tRNA合成酶的編碼基因以多順反子形式被組成型啟動子驅動表達；所述報告蛋白自N端至C端包括如下兩個區段：標簽蛋白區段、SAMP1_G24amb蛋白區段；SAMP1_G24amb蛋白區段對應于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸殘基，并且相對于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸殘基的編碼基因而言，SAMP1_G24amb蛋白區段的編碼基因中進行了一個密碼子替換，該密碼子為SAMP1蛋白的第24位氨基酸殘基的密碼子，由甘氨酸密碼子替換為了“TAG”；

(2)將具有功能元件表達框的重組表達載體導入目標菌株，得到重組菌；

(3)在含有非天然氨基酸的環境中培養重組菌，然后檢測重組菌中報告蛋白的表達情況。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，采用蛋白免疫印跡法檢測重組菌的全菌蛋白中報告蛋白的表達情況。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目標菌株為嗜鹽底盤菌。

4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：具有功能元件表達框的重組表達載體先借助甲基化系統缺失的大腸桿菌進行擴繁，再導入所述目標菌株。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于：所述重組表達載體的出發載體為可在大腸桿菌和沃氏富鹽菌中復制的穿梭質粒。

6.如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：功能元件表達框中，報告蛋白的編碼基因和目標氨酰-tRNA合成酶的編碼基因被組成型強啟動子驅動表達，由T7終止子介導轉錄終止。

7.如權利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：功能元件表達框中，待測tRNA的編碼基因被tRNA^Lys啟動子驅動表達，由rrnC終止子介導轉錄終止。

8.如權利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：功能元件表達框中，報告蛋白的編碼基因上游具有核糖體結合位點。

9.如權利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：功能元件表達框中，待測氨酰-tRNA合成酶的編碼基因上游具有核糖體結合位點。

10.一種檢測翻譯工具是否具有合成非天然氨基酸的蛋白質的活性的試劑盒；

所述翻譯工具為待測氨酰-tRNA合成酶和待測tRNA；

所述試劑盒包括特異DNA分子；

所述特異DNA分子包括如下元件：報告蛋白的編碼基因、供待測氨酰-tRNA合成酶的編碼基因插入的位點甲、供待測tRNA的編碼基因插入的位點乙；所述報告蛋白自N端至C端包括如下兩個區段：標簽蛋白區段、SAMP1_G24amb蛋白區段；SAMP1_G24amb蛋白區段對應于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸殘基，并且相對于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸殘基的編碼基因而言，SAMP1_G24amb蛋白區段的編碼基因中進行了一個密碼子替換，該密碼子為SAMP1蛋白的第24位氨基酸殘基的密碼子，由甘氨酸密碼子替換為了“TAG”；

使用時，將待測氨酰-tRNA合成酶的編碼基因插入位點甲、待測tRNA的編碼基因插入位點乙；報告蛋白的編碼基因和待測氨酰-tRNA合成酶的編碼基因以多順反子形式被組成型啟動子驅動表達。