[發明專利]商業地熊蜂與野生地熊蜂的差異INDEL及其分子標記與應用

有效

• 申請號: 202011013158.4
• 申請日: 2020-09-24
• 公開（公告）號: CN111850142B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 孫成;蘇龍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

1.一種用于區分商業地熊蜂與野生地熊蜂的方法，其特征在于，檢測待測地熊蜂的特異INDEL位點的基因型為商業型還是野生型的方法為：

用成套引物對所述待測地熊蜂基因組DNA進行KASP擴增，得到KASP擴增產物；檢測KASP擴增產物的熒光信號或熒光信號值：

若所述KASP擴增產物僅顯示序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端連接熒光序列的顏色為FAM，則待測地熊蜂的特異INDEL位點的基因型為野生型；若所述KASP擴增產物僅顯示序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端連接熒光序列的顏色為HEX，則待測地熊蜂的特異INDEL位點的基因型為商業型；

或若序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端連接熒光序列的熒光信號值與對應序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端連接熒光序列的熒光信號值的比值FAM/HEX大于或等于3.5，則該地熊蜂在特異INDEL位點的基因型為野生型；若序列NC14757029FAMF1、NW623097FAMF1、NC16893418FAMF1所示DNA分子5'端連接熒光序列的熒光信號值與對應序列NC14757029HEXF1、NW623097HEXF1、NC16893418HEXF1所示DNA分子5'端連接熒光序列的熒光信號值的比值FAM/HEX小于0.5,則該地熊蜂在特異INDEL位點的基因型為商業型；

用于檢測共顯性標記NC14757029的引物組如下：

NC14757029FAMF1：

5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTG -3’；

NC14757029HEXF1：

5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTTG -3’；

NC14757029R：5’- CGATAAATGCGTGCAAAGTGGTT -3’；

用于檢測共顯性標記NW623097的引物組如下：

NW623097FAMF1：

5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCT -3’；

NW623097HEXF1：

5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCC -3’；

NW623097R：5’- ACACGTTGTATCACCGGTCTAAAT -3’；

用于檢測共顯性標記NC16893418的引物組如下：

NC16893418FAMF1：

5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAAATAATTTCCTTACAGGTGAAAAAAC -3’；

NC16893418HEXF1：

5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTGAAGACGGTAATAGTACAGTGT -3’；

NC16893418R：5’- TTCCGTAGTTCCAAGACTATCCAAA -3’；

以上序列所示的單鏈DNA分子的5'端連接一種熒光序列；

檢測待測地熊蜂的三個特異INDEL位點基因型都為野生型還是商業型；若三個特異INDEL位點的基因型都為商業型，則該地熊蜂為或候選為商業化地熊蜂；若特異INDEL位點的基因型都為野生型，則該地熊蜂為或候選為野生地熊蜂；

位點NC14757029KASP擴增體系10μl：含100ng模板DNA、0.12μM NC14757029FAMF1、0.12μM NC14757029HEXF1、0.3μM NC14757029R、5μL KASP試劑，余量為水；

位點NW623097KASP擴增體系10μl：含100ng模板DNA、0.12μM NW623097FAMF1、0.12μMNW623097HEXF1、0.3μM NW623097R、5μL KASP試劑，余量為水；

位點NC16893418KASP擴增體系10μl：含100ng模板DNA、0.12μM NC16893418FAMF1、0.12μM NC16893418HEXF1、0.3μM NC16893418R、5μL KASP試劑，余量為水；

KASP擴增程序：94℃預變性15min；94℃變性20s，61℃-55℃退火45s，第一個循環退火溫度為61℃，之后每個循環比上一個循環降低0.6℃，最后一個循環退火溫度為55℃，10個循環；94℃變性20s，55℃退火45s，36個循環；10℃保存。