[發明專利]一種雙基因修飾的干細胞及其用途

有效

• 申請號: 202011012627.0
• 申請日: 2020-09-23
• 公開（公告）號: CN112143705B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 段海峰;薛冰華;于婷婷;解晶;龐如夢;劉麗華
• 申請（專利權）人: 北京華奧玄德生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/16;C12N15/54;A61K35/28;A61P3/10;A61P3/04;A61P3/06;A61P3/00;A61P9/10
• 代理公司: 北京華夏泰和知識產權代理有限公司 11662
• 代理人: 王衛忠

1.一種雙基因修飾的干細胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

步驟1，獲得第一外源核酸和第二外源核酸，酶切后與載體質粒pCDH-EF1連接，得到重組質粒pCDH-AQS，其結構如附圖圖1所示；

所述第一外源核酸為脂聯素基因，第一外源核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

第二外源核酸為突變的鞘氨醇激酶1基因，所述突變的鞘氨醇激酶1基因為將其GKGK結構域中的兩個K分別突變為精氨酸或谷氨酰胺，第二外源核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述第一外源核酸和第二外源核酸包含于相同的表達載體中；

所述第一外源核酸和第二外源核酸通過編碼自我切割肽的序列連接，所述編碼自我切割肽的序列如SEQ ID NO:6所示；

所述連接后的第一外源核酸和第二外源核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述連接后的第一外源核酸和第二外源核酸編碼如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白；

步驟2，將重組質粒與包裝質粒進行慢病毒包裝細胞的轉染，得到含有第一外源核酸和第二外源核酸的重組慢病毒載體；

步驟2包括以下子步驟：

步驟2-1，培養包裝細胞；所述包裝細胞為293T細胞；

步驟2-2，轉染包裝細胞；

將包裝質粒與步驟1獲得的重組質粒pCDH-AQS混合，溫育后加入轉染試劑，室溫孵育，形成DNA-脂質體轉染復合物；將DNA-脂質體轉染復合物與包裝細胞混合均勻，培養，獲得重組慢病毒載體；

所述包裝質粒為Helper1質粒、Helper2質粒和Helpher3質粒，重組質粒、Helper1質粒、Helper2質粒和Helpher3質粒的質量比為2:1:1:1；

步驟3，將上述獲得的重組慢病毒載體轉染至間充質干細胞，得到雙基因修飾的干細胞；

所述間充質干細胞來源于臍帶。

2.一種權利要求1所述的方法制備的雙基因修飾的干細胞在制備治療代謝疾病藥物中的應用，所述代謝疾病選自肥胖、II型糖尿病、血脂異常、胰島素耐受和動脈粥樣硬化。