[發明專利]幾丁質脫乙酰酶基因、幾丁質脫乙酰酶及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011011189.6
• 申請日: 2020-09-23
• 公開（公告）號: CN112175974A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 王建榮;王平;祝木金;余思;孔建;曹革
• 申請（專利權）人: 深圳潤康生態環境股份有限公司;深圳諾普信農化股份有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/80;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/26;C12R1/84
• 代理公司: 深圳中一聯合知識產權代理有限公司 44414
• 代理人: 郝文婷

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種幾丁質脫乙酰酶基因、幾丁質脫乙酰酶及其制備方法和應用。本發明幾丁質脫乙酰酶基因cdaba的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其是通過對來源于萎縮芽孢桿菌Bacillus atrophaeus幾丁質脫乙酰酶的序列進行綜合優化得到。本發明幾丁質脫乙酰酶CdaBa的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其不僅豐富了幾丁質脫乙酰酶的種類和來源途徑，而且酶比活可達352U/mg，在較寬的溫度范圍和較寬的pH范圍內均表現出良好的穩定性，具有良好的應用前景和產業價值。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及幾丁質脫乙酰酶基因cdaba及相應的重組表達載體、重組表達菌株，以及幾丁質脫乙酰酶CdaBa及其制備方法和應用。

背景技術

幾丁質是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵隨機連接而成的直鏈多聚物，其結構與纖維素類似，是自然界僅次于纖維素的可再生多糖。幾丁質由于其致密的結晶結構使其溶解性很差，幾乎不溶于水、稀酸、稀堿、濃堿及一般有機溶劑，從而限制了幾丁質的商業化應用。通過研究發現，幾丁質的的衍生物殼聚糖(幾丁質脫去乙酰基團后的產物)可以很好的溶于稀硝酸、鹽酸、醋酸等無機酸和大多數有機酸，此外通過研究發現殼聚糖具有抑菌、抗癌、降血壓等生物活性，可以應用于醫藥、食品等行業。

目前將幾丁質轉化為殼聚糖的主流方法是化學法，化學法通過應用大量濃堿脫去幾丁質的乙酰基團獲得殼聚糖。該方法雖然高效，但是具有很多缺點如：破壞幾丁質的結構、脫乙酰過程很難精準控制、反應排放物對環境污染嚴重等，因此尋找綠色高效的加工方法具有重要意義。幾丁質脫乙酰酶可以催化幾丁質脫乙酰基形成殼聚糖，該方法屬于酶法轉化，具有脫乙酰度高、脫乙酰程度一致、反應條件溫和、產物結構完整、過程易于控制、對環境無污染等優點。目前限制幾丁質酶法脫乙酰產業化應用的主要問題在于幾丁質脫乙酰酶發酵活力低，生產成本高，導致酶法工藝整體生產成本高。因此提升幾丁質脫乙酰酶的發酵酶活，降低其生產成本是幾丁質酶法脫乙酰廣泛應用的基礎。

發明內容

本發明的目的是提供幾丁質脫乙酰酶基因cdaba及相應的重組表達載體、重組表達菌株，以及幾丁質脫乙酰酶CdaBa及其制備方法和應用，旨在解決現有幾丁質脫乙酰酶存在的發酵活力低的技術問題。

為了實現上述發明目的，本發明一方面，提供了一種幾丁質脫乙酰酶基因cdaba，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經缺失、插入或替換所得具有相同功能的核苷酸序列。

本發明另一方面，提供了一種幾丁質脫乙酰酶CdaBa，所述幾丁質脫乙酰酶CdaBa是本發明所述幾丁質脫乙酰酶基因cdaba編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由所述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經缺失、插入或替換所得具有相同功能的氨基酸序列。

本發明再一方面，提供了一種重組表達載體，其包括本發明提供的幾丁質脫乙酰酶基因cdaba。

本發明又一方面，提供了一種重組表達菌株，其包括本發明提供的重組表達載體。

本發明還有一方面，提供了一種幾丁質脫乙酰酶CdaBa的制備方法，其包括如下步驟：

提供幾丁質脫乙酰酶基因cdaba、表達載體和表達菌株；

對所述幾丁質脫乙酰酶基因cdaba進行擴增，所得擴增產物與所述表達載體進行連接，得到重組表達載體；

將所述重組表達載體轉入表達菌株，得到重組表達菌株；

對所述重組表達菌株進行培養，得到幾丁質脫乙酰酶CdaBa；