[發(fā)明專利]一種用于茄子育種的原生質(zhì)體電融合方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011008207.5 | 申請日： | 2020-09-23 |
| 公開（公告）號： | CN112063613A | 公開（公告）日： | 2020-12-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李燁;姜景彬;曹必好;李煒;許向陽;李景富;李宇 | 申請（專利權(quán)）人： | 哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學院 |
| 主分類號： | C12N15/05 | 分類號： | C12N15/05;C12N13/00;C12N5/14 |
| 代理公司： | 哈爾濱市偉晨專利代理事務(wù)所(普通合伙) 23209 | 代理人： | 趙君 |
| 地址： | 150028 黑龍江*** | 國省代碼： | 黑龍江;23 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 茄子 育種 原生 質(zhì)體 融合 方法 | ||
1.一種用于茄子育種的原生質(zhì)體電融合方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟一、酶解制備原生質(zhì)體：
取1#茄子幼苗嫩葉和2#茄子幼苗嫩葉作為親本制備原生質(zhì)體，將幼苗嫩葉切成大小一致的組織片并分別置于CPW13M溶液中密封預(yù)處理30min，過濾去除CPW溶液，將組織片分別置于CPW9M溶液中清洗2～3次；
按一定茄子幼苗嫩葉與酶解液的質(zhì)量體積比將所得預(yù)處理后的組織片分別放入酶解液中，分別封好封口膜后置于一定溫度、轉(zhuǎn)速下，于黑暗條件下進行酶解，分別得到兩種親本的酶解產(chǎn)物；
步驟二、分離純化原生質(zhì)體：
將步驟一所得兩種親本的酶解產(chǎn)物分別依次過篩，收集兩種親本的原生質(zhì)體粗溶液，離心收集沉淀并用CPW鹽質(zhì)量濃度為9％的CPW水溶液重復(fù)洗滌離心1～2次，分別獲得分離純化后的1#茄子原生質(zhì)體和2#茄子原生質(zhì)體；
步驟三、原生質(zhì)體鈍化處理：
將步驟二所得1#茄子原生質(zhì)體置于離心管中，用碘乙酰胺鈍化其細胞質(zhì)：用CPW10M溶液將步驟二得到的1#茄子原生質(zhì)體沉淀調(diào)成原生質(zhì)體密度為3×105個/mL的懸液，向1#茄子原生質(zhì)體懸液中加入碘乙酰胺處理液進行鈍化處理，離心收集1#茄子原生質(zhì)體，用CPW水溶液洗滌后備用；
將步驟二所得2#茄子原生質(zhì)體置于培養(yǎng)皿中，用紫外線鈍化其細胞核：用CPW10M溶液將步驟二所得2#茄子原生質(zhì)體沉淀調(diào)成原生質(zhì)體密度為1.5×105個/mL的懸液，取原生質(zhì)體懸液置于無蓋培養(yǎng)皿中，以紫外線照射進行鈍化處理；
步驟四、原生質(zhì)體促融處理：
將步驟三所得經(jīng)過鈍化處理的1#茄子原生質(zhì)體鈍化處理液和2#茄子原生質(zhì)體鈍化處理液用EGTA進行促融處理：以氯化鈉溶液為溶劑、以EGTA為溶質(zhì)配制EGTA促融液，將1#茄子原生質(zhì)體和2#茄子原生質(zhì)體分別平鋪于培養(yǎng)皿中，按一定的原生質(zhì)體鈍化處理液與EGTA促融液的體積比分別向培養(yǎng)皿中加入所述EGTA促融液進行促融處理，收集促融處理后的1#茄子原生質(zhì)體混懸液和2#茄子原生質(zhì)體混懸液，待用；
步驟五、原生質(zhì)體的電融合處理：
將步驟四所得促融處理后的1#茄子原生質(zhì)體混懸液和2#茄子原生質(zhì)體混懸液等體積混合后放入電融合儀的融合小室中進行電融合，融合結(jié)束后吸取融合小室內(nèi)的融合液并用一定摩爾濃度的甘露醇溶液定容至1mL，取其稀釋液涂布于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于27℃恒溫避光培養(yǎng)6～8周即可形成愈傷組織團塊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于茄子育種的原生質(zhì)體電融合方法，其特征在于，步驟一所述CPW13M溶液以質(zhì)量體積比為13％的甘露醇溶液為溶劑，以CPW鹽為溶質(zhì)配制而成；所述CPW9M溶液以質(zhì)量體積比為9％的甘露醇溶液為溶劑，以CPW鹽為溶質(zhì)配制而成；所述CPW鹽的配方為KH2PO427.2mg/L、KNO3101.0mg/L、CaCl2·2H2O 1480.0mg/L、MgSO4·7H2O246.0mg/L、KI 0.16mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L，pH 5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種用于茄子育種的原生質(zhì)體電融合方法，其特征在于，步驟一所述酶解液以CPW鹽的水溶液為溶劑，含有如下質(zhì)量濃度的組分：1～2％纖維素酶、0.1～0.2％果膠酶、6～12％甘露醇；步驟一所述茄子幼苗嫩葉與酶解液的質(zhì)量體積比為1g：15～30mL；所述酶解溫度為35～45℃，所述轉(zhuǎn)速為50～100r/min，所述酶解時間為3～6h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種用于茄子育種的原生質(zhì)體電融合方法，其特征在于，所述纖維素酶的酶活為20000～30000U，所述果膠酶的酶活為10000～60000U。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種用于茄子育種的原生質(zhì)體電融合方法，其特征在于，步驟一所述酶解液中還含有6～8mmol/100mL的抗壞血酸。
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