[發明專利]生產L-乳酸的重組大腸桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202011006212.2
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112852693B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 張學禮;劉萍萍;唐金磊
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/53;C12N9/04;C12P7/56;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 任鳳華

本發明公開了生產L?乳酸的重組大腸桿菌及其應用。本發明所要保護的重組大腸桿菌不含有D?乳酸脫氫酶基因，含有L?乳酸脫氫酶突變體基因，所述重組大腸桿菌表達所述L?乳酸脫氫酶突變體基因，所述L?乳酸脫氫酶突變體基因編碼氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白質。使用該重組大腸桿菌厭氧發酵48小時后，L?乳酸產量達150g/L，產率達1.90mol/mol，光學純度接近100％，表明本發明所構建獲得的重組大腸桿菌可高產高光學純度的L?乳酸，可應用于在生物發酵領域中生產高品質L?乳酸。

技術領域

本發明涉及工業微生物領域，具體涉及生產L-乳酸的重組大腸桿菌及其應用。

背景技術

L-乳酸作為一種重要的有機酸，被廣泛用于食品、醫藥、煙草和化工等行業。另外，隨著對綠色環保型材料需求的增加，未來L-乳酸最重要的用途是作為單體用于合成生物可降解材料聚乳酸(PLA)。聚乳酸作為一種新型的生物可降解材料，因其優異的綜合性能被廣泛用于服裝、建筑、農林業和醫藥行業。同時，聚乳酸因使用后可以被自然界中的微生物完全降解生成二氧化碳和水而被公認為是一種環境友好材料。因此，隨著PLA應用越來越廣泛，L-乳酸在未來的市場潛力也將越來越大。

乳酸生產方式主要包括微生物發酵法、化學合成法和酶催化法。其中，酶催化法由于發酵方法復雜，尚未有工業化生產使用。化學法可實現乳酸的大規模連續化生產，且合成乳酸也已得到美國食品和藥品管理局(FDA)的認可，但其原料主要是石油基化學品，因此受原油供應及價格波動影響較大。另外，化學合成涉及大量有毒物質且生產的乳酸沒有光學特異性，因此工業中應用相對較少。以可再生原料，如玉米淀粉或木薯粉等為底物利用微生物通過發酵生產乳酸的方法可以高效合成特定光學特性的乳酸。目前發酵法生產的乳酸約占全球乳酸生產的70％以上。

自然界中有許多天然生產乳酸的細菌，這些細菌物種豐富多樣，在自然界中分布廣泛，如乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、雙歧桿菌屬和乳球菌屬等。這些細菌耐酸性強，遺傳改造后可以實現同型發酵生產L-乳酸。但是這些細菌發酵過程需要豐富培養基，不能利用五碳糖，這極大地提高了生產成本和下游分離純化的成本。另外，該類菌通常使用氫氧化鈣或碳酸鈣作為中和劑來控制發酵pH，最終的發酵產物是乳酸鈣。而乳酸鈣在分離提取的過程中通常需要加入硫酸，會產生大量的硫酸鈣廢物，難以處理。更重要的是，該類菌生產的L-乳酸通常手性純度都在98％以下，達不到聚乳酸生產的要求。

隨著合成生物學和代謝工程的發展，通過理性設計和遺傳改造獲得的工程菌可以在L-乳酸手性、工程菌底物利用范圍、菌株耐受性等方面顯著改善乳酸生產的性能指標。因此，通過基因組范圍代謝育種，設計并構建適應工業化生產需求，能夠低成本、高轉化率生產高光學純度L-乳酸的工程菌株并用于生產高品質L-乳酸在生物發酵領域依舊具有很強的必要性。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何高產高光學純度高質量的L-乳酸或如何獲得高轉化率生產高光學純度L-乳酸的工程菌株。

為了解決上述技術問題，本發明首先提供了一種重組大腸桿菌。

所述重組大腸桿菌不含有D-乳酸脫氫酶基因，含有L-乳酸脫氫酶突變體基因，所述L-乳酸脫氫酶突變體基因編碼氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質。

所述L-乳酸脫氫酶突變體基因為下述任一種DNA分子：

c1、編碼鏈的編碼序列是序列表中序列3的89-1051位核苷酸的DNA或cDNA分子；

c2、在嚴格條件下與c1限定的DNA分子雜交且編碼所述L-乳酸脫氫酶突變體的DNA或cDNA分子；

c3、與c1或c2限定的DNA分子具有80％以上的同一性且編碼所述L-乳酸脫氫酶突變體的DNA或cDNA分子。