[發明專利]高產核苷的枯草芽孢桿菌工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202011003905.6
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112143751B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 孫瑩瑩;胡丹;白立寬;吳濤
• 申請（專利權）人: 廊坊梅花生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/90;C12N15/67;C12N15/52;C12N15/60;C12P19/40;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供高產核苷的枯草芽孢桿菌工程菌及其構建方法與應用。本發明還提供發酵生產核苷的方法，包括：(1)增強枯草芽孢桿菌染色體上編碼NCBI參考序列WP_009967365.1的谷氨酸合酶基因gltA；和/或增強枯草芽孢桿菌染色體上編碼NCBI參考序列WP_003231737.1的谷氨酰胺合成酶基因glnA；(2)將步驟(1)獲得的基因增強菌株用于核苷的發酵生產。本發明提供的枯草芽孢桿菌工程菌為核苷高產菌株，能有效積累核苷，提高核苷的產量，為核苷的工業化生產奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及微生物領域和生物工程技術領域，具體地說，涉及高產核苷的枯草芽孢桿菌工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

核苷是一類糖苷的總稱。核苷是核酸和核苷酸的組成成分。核苷是由D-核糖或D-Z-脫氧核糖與嘧啶堿或嘌呤堿縮合而成。核苷一般為無色結晶，不溶于普通有機溶劑，易溶于熱水，熔點為160-240℃。由D-核糖生成的核苷稱核糖核苷，參與RNA組成，由D-α-脫氧核糖生成的核苷稱脫氧核糖核苷，參與DNA組成。D-核糖與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶縮合生成相應的腺嘌呤核糖核苷、鳥嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它們分別簡稱為腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。

腺苷即腺嘌呤核苷，化學名為6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氫嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脫磷酸后的產物，屬于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一種遍布人體細胞的內源性核苷，可直接進入心肌經磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時還參與擴張冠脈血管，增加血流量。腺苷對心血管系統和肌體的許多其它系統及組織均有生理作用。腺苷除了可以用作治療心臟的特效藥物之外，還是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中間體，廣泛應用于醫藥等行業。

鳥苷，化學名稱：9-β-D-呋喃核糖鳥嘌呤。它可作為食品或醫藥原料的中間體，用于生產5’-鳥苷酸二鈉、鳥嘌呤、利巴韋林、阿昔洛韋、泛昔洛韋等食品添加劑或醫藥原料。

肌苷，化學名稱：9-β-D-核糖次黃嘌呤。是細胞代謝改善藥，參與體內核酸代謝，在體內轉變為肌苷酸及三磷酸腺苷，參與細胞的能量代謝和蛋白質合成，提高各種酶，特別是輔酶A與丙酮酸氧化酶的活性，從而使細胞在缺氧狀態下繼續進行代謝，活化肝臟功能，促進受損傷肝臟的恢復，可刺激體內產生抗體并促進腸道對鐵的吸收。適用于各種慢性肝臟疾患、心臟疾患、白血球或血小板減少癥、中心性視網膜炎等，并可預防接觸銻劑引起的對肝臟心臟的副作用。

嘌呤核苷既可通過化學法合成，也可通過微生物發酵法合成，并且微生物發酵法由于其諸多的優勢(條件溫和、環境污染小)，已成為主流生產方法。但發酵法的缺點是成本高、轉化率低。因此，亟需通過代謝工程的手段，改善菌種性能。

發明內容

本發明的目的是提供一種發酵生產核苷的方法或提高核苷發酵產量的方法。

本發明的另一目的是提供高產核苷的枯草芽孢桿菌工程菌及其構建方法與應用。

本發明構思如下：核苷合成對氮同化的需求遠高于氨基酸合成，腺嘌呤環涉及5個氮同化，其中2個來自谷胺酰胺。發明人在研發中意外地發現，通過增強核苷合成代謝過程中的氮供應可以明顯地促進嘌呤核苷的合成，且強化氮供應的方式不止一種，組合強化可起到疊加的效果。

盡管gltB不是核苷合成的關鍵基因，卻是谷氨酸合酶合成的關鍵基因，該酶催化谷氨酸合成；而glnA又是谷氨酰胺合成酶的關鍵基因，催化谷氨酸向谷氨酰胺合成。本發明通過gltB點突變、gltB和glnA強啟動子替換達到gltB和glnA基因強化目的。

gltB強化條件下，促進谷氨酸合成，glnA強化條件下，促進谷氨酰胺合成，谷氨酰胺是核苷合成的直接前體，進一步滿足核苷合成氮同化需求。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種發酵生產核苷的方法或提高核苷發酵產量的方法，包括以下步驟：