[發明專利]一種基于高通量測序的FGFRs基因突變的檢測方法及探針序列

有效

• 申請號: 202011001862.8
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112301115B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 陳學俊;黃紅偉;石銀;鄭立謀
• 申請（專利權）人: 廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學明

本發明涉及一種基于高通量測序的FGFRs基因突變的檢測方法及探針序列，包括如下步驟：1)共提取樣本基因組DNA及總RNA；2)基因組DNA進行片段化及片段化DNA回收；3)根據總RNA質控情況進行總RNA打斷和/或引物雜交；3)合成cDNA第一鏈；4)合成cDNA第二鏈；5)將片段化后的DNA與cDNA混合構建混合文庫；6)采用捕獲探針進行雜交和捕獲；7)捕獲后文庫擴增及純化；8)高通量測序及突變分析。本發明能夠檢測FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因單堿基突變、插入缺失突變及融合突變及相對表達量分析。

技術領域

本發明涉及一種基于高通量測序平臺開發的FGFRs(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)基因突變檢測方法。

背景技術

成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)是高度保守，分布廣泛的跨膜酪氨酸激酶受體。它們參與發育，分化，細胞存活，遷移，血管生成和致癌作用。目前，國內外頂尖藥企，正在研發多種FGFR靶向藥，包括Erdafitinib(厄達替尼)、BGJ398、AZD4547和BLU-554等第一代藥物，其中Erdafitinib已經獲批上市，同時針對一代耐藥后的第二代FGFR靶向藥TAS-120也都處于臨床評估階段，針對這些靶向藥物的用藥靶點的伴隨診斷臨床檢測需求也日漸旺盛。在人類中，有四種FGFR典型的酪氨酸激酶受體(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR14)，2015年在clinical cancer research期刊中發表了用下一代測序技術描述了來自各種癌癥的4853個患者樣品中FGFR的突變情況，包括突變，融合和擴增。在測序的4853種癌癥中，該研究觀察到343例病例中有360個FGFR突變，共涉及17個癌種，總發生率為7.1％。在360個FGFR突變中，點突變及插入缺失突變點基因約占26％，基因融合突變約占8％。

基于FGFRs基因突變類型的多樣性，包括點突變、插入缺失突變、融合突變、擴增/過表達突變，臨床的檢測需求也是多樣的，需要一種能夠檢測FGFRs多種突變類型的方法；同時受限于樣品量，樣本質量不高，以及考慮到終端檢測應用的經濟性。現有FGFRs基因突變檢測方法有諸多不足之處。

基于熒光原位雜交(FISH)的FGFR2基因融合突變檢測技術是先根據FGFR2基因上下游分別設計5’端探針組及3’端探針組，并標記不同熒光基團，通過觀察顯微鏡下原位雜交的熒光信號分離程度，判別是否發生融合突變。該方法僅能用于鑒別FGFR2基因是否發生了融合突變，無法確定融合伴侶基因及具體斷點位置，也無法檢測FGFRs基因的點突變、插入缺失突變等其他突變類型。

基于單獨的依靠DNA樣本的擴增子或靶向捕獲高通量檢測技術通過設計FGFRs基因CDS區域的擴增引物或捕獲探針，也可以實現對FGFRs基因點突變、插入缺失突變的檢測，但對于融合突變檢測，擴增子靶向測序技術，僅能夠根據已知融合斷點設計擴增引物，無法適用于融合發生于內含子區域的斷點未知的DNA樣本，且對樣本質量也有一定要求；而對于靶向捕獲測序技術，理論上捕獲探針需要覆蓋基因的所有內含子區域，才能覆蓋所有的FGFRs基因的融合突變類型，檢測區域相比于僅檢測CDS區擴大15倍，預期的測序數據量及測序成本也將增加15倍，導致檢測成本過高，經濟性差。

基于分別依靠DNA樣本及RNA樣本進行的靶向捕獲高通量檢測技術，可以對DNA外顯子區域設計擴增引物或捕獲探針，實現點突變、插入缺失突變的檢測，對于采用RNA樣本進行融合突變檢測的擴增子靶向測序技術，僅能夠根據已知融合斷點設計擴增引物，實現已知融合突變類型的檢測，不能檢測未知的融合突變；而對于靶向捕獲測序技術，可以實現已知融合突變及未知融合突變的檢測，但2種樣本類型均需要分別進行雜交捕獲步驟，導致檢測操作復雜，檢測成本加倍，適用性及經濟性較差。

綜上所述，目前FGFRs突變檢測方法還不夠成熟，可用的檢測方法，受限于本身技術原理不適用，檢測突變類型不全，檢測成本過高或檢測操作過于復雜，無法滿足日益增長的檢測需求，因此，急需一種檢測突變類型全面，檢測成本低，檢測步驟較為簡單，能夠滿足FGFRs臨床檢測需求的方法。

發明內容