[發明專利]一種高效表達超螺旋質粒DNA的大腸桿菌發酵方法

在審

• 申請號: 202011001591.6
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112063562A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 蘇月焱;芮勉文;田超;萬瑤瑤;孫麗慧;羅琦;趙卿
• 申請（專利權）人: 南京濟群生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/38;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種大腸桿菌高效表達螺旋質粒DNA的發酵方法，其特征在于：

(1)搖瓶種子的復蘇及制備

將低溫凍存的菌種復蘇培養,再經繼代培養得到菌種；

(2)接種

接種并測定OD₆₀₀值,然后將稀釋的種子溶液轉移到預先滅菌的無菌接種瓶中；

(3)發酵

將步驟(2)獲得的培養液加入到含有基礎培養基的一次性培養袋中，基礎培養基已預先經過濕熱滅菌，接種發酵罐后開始發酵，當pH值≥6.75時，啟動補料，補料持續至發酵結束。

2.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于：步驟(3)所述補料方法為：采用連續的補料方式，測定補料起始點的OD₆₀₀值，以起始補料時間點為起點，每1-2小時取樣測定發酵液的OD₆₀₀值，根據公式：

μ＝ln(C_前/C_后)/T

—μ：比生長速率；

—C_前：前一個時間點的菌體OD₆₀₀值；

—C_后：后一個時間點的菌體OD₆₀₀值；

—T:兩個時間點的時間間隔；

計算比生長速率，根據計算的比生長速率在每個測定OD₆₀₀值的時間點在原補料量的基礎上增加5％-50％補料量以控制下個時間段的比生產速率在0.00-0.20范圍內；當發酵液的OD₆₀₀達到60-80時，將培養溫度從30℃調整為42℃進行溫度誘導，同時根據比生長速率控制的變化流加補料培養基；在溫度誘導10-14小時后，根據質粒測定的產量與質量結果確定菌體的收獲時間。

3.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于：步驟(1)所述的復蘇培養需將低溫凍存的菌種在搖瓶中用LB培養基稀釋數倍后進行復蘇培養。

4.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于：步驟(1)所述的繼代培養需滿足0.5≤OD₆₀₀≤3.0。

5.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于：步驟(2)所述的稀釋種子溶液濃度為0.001≤OD₆₀₀≤0.005。

6.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于：對步驟(3)獲取的質粒DNA應對濃度及質量進行檢測。

7.根據權利要求2所述的發酵方法，其特征在于：所述補料培養基的成分包括：C源、N源、氨基酸、維生素、微量元素和消泡劑。

8.根據權利要求3所述的發酵方法，其特征在于：所述補料培養基C源含量不超過60％；N源含量不超過15％；氨基酸含量不超過8％；維生素含量不超過5％；其他微量元素含量不超過2％；消泡劑含量不超過0.05％；pH控制在7.0-7.4。

9.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于：所述基礎培養基的成分包括：C源、N源、氨基酸、維生素、消泡劑和其他微量元素。

10.根據權利要求5所述的發酵方法，其特征在于：所述基礎培養基C源含量不超過5％；N源含量不超過2％；氨基酸含量不超過1％；維生素含量不超過0.5％；其他微量元素含量不超過1％；消泡劑含量不超過0.05％，pH控制在6.7-7.3。

11.根據權利要求2所述的發酵方法，其特征在于：所述補料方法中，補料起始量為0.5-0.8ml/min。

12.根據權利要求2所述的發酵方法，其特征在于：所述補料方法中，pH初始設定值范圍為7.0±0.3。