[發(fā)明專利]一種用于卡氏肺孢子菌和弓形蟲檢測的引物、探針和試劑盒及檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011000465.9
• 申請(qǐng)日: 2020-09-22
• 公開（公告）號(hào): CN111926007B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊國威;吳云;栗紹剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/6893;C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/06
• 代理公司: 北京領(lǐng)科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

本發(fā)明公開了一種用于卡氏肺孢子菌和弓形蟲檢測的引物、探針和試劑盒及檢測方法，特別是用于卡氏肺孢子菌和弓形蟲雙重?zé)晒舛縋CR檢測的試劑盒和檢測方法。本發(fā)明利用卡氏肺孢子菌和弓形蟲保守區(qū)設(shè)計(jì)引物對(duì)和探針，篩選出能特異性擴(kuò)增出卡氏肺孢子菌和弓形蟲的引物對(duì)和探針，且靈敏度高，兩對(duì)引物及兩條探針相互之間無干擾，能準(zhǔn)確檢測出僅僅含有1拷貝的樣本；利用該引物對(duì)、探針和檢測方法能夠絕對(duì)定量出卡氏肺孢子菌和弓形蟲的含量，檢測安全、快速方便，可用于卡氏肺孢子菌和弓形蟲的檢測，以及跟蹤監(jiān)測患者藥物的治療效果，有利于開展流行病學(xué)調(diào)查，預(yù)防和控制卡氏肺孢子菌和弓形蟲的傳播。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于卡氏肺孢子菌和弓形蟲檢測的引物、探針和試劑盒及檢測方法，特別是用于卡氏肺孢子菌和弓形蟲雙重?zé)晒舛縋CR檢測的試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)

卡氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonia）的病原體為卡氏肺孢子菌（pneumocystis carinii, PC），對(duì)人類是條件致病菌，在正常人體內(nèi)很少能引起疾病，多發(fā)生于艾滋病人、移植患者等免疫功能低下人群。卡肺被認(rèn)為是艾滋病的標(biāo)志性疾病，超過85%的HIV感染者一生都會(huì)受其影響，是AIDS致死的主要原因。器官移植術(shù)后患者因長期服用免疫抑制劑，易患卡肺，本病臨床癥狀及影像學(xué)上無特異性表現(xiàn)，早期若延誤治療可導(dǎo)致嚴(yán)重后果，未經(jīng)治療患者病死率為100%。

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲，可導(dǎo)致腦弓形蟲病或全身其他器官的損害，肺損害的發(fā)生率排在弓形蟲病腦外器官損害的第二位，肺弓形蟲病既可發(fā)生在免疫功能缺陷人群又可發(fā)生在免疫功能正常的人群，臨床上肺弓形蟲病的影像學(xué)特征與卡氏肺孢子蟲很相似，因此臨床上常將其誤認(rèn)為卡氏肺孢子蟲病。肺弓形蟲病臨床表現(xiàn)嚴(yán)重、病程發(fā)展快、病死率高，且診斷困難。

目前，臨床上應(yīng)用的卡氏肺孢子菌檢測方法主要包括鏡檢和PCR。肺泡灌洗液的鏡檢檢出率較痰液標(biāo)本有了很大的提高，但鏡檢敏感度依然偏低，容易造成漏診。熒光定量PCR方法具有高敏感度和高特異性，且可以準(zhǔn)確定量，在卡氏肺孢子菌的檢驗(yàn)中具有很好的應(yīng)用前景。弓形蟲的檢測方法臨床上應(yīng)用的包括鏡檢、抗體檢測和PCR。鏡檢方法敏感性低，抗體檢測不能區(qū)分是正在感染還是既往感染，而PCR方法不僅敏感度高，同時(shí)可對(duì)患者的蟲荷進(jìn)行監(jiān)測，對(duì)臨床診斷和治療均有較好的指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有卡氏肺孢子菌和弓形蟲檢測技術(shù)的缺陷和不足，提供一種檢測卡氏肺孢子菌和弓形蟲的引物對(duì)和探針。該引物對(duì)和探針能夠安全、快速、方便地絕對(duì)定量出人痰液或肺泡灌洗液中卡氏肺孢子菌和弓形蟲含量，靈敏度高，可用于卡氏肺孢子菌和/或弓形蟲的檢測，以及跟蹤監(jiān)測患者藥物的治療效果，有利于及時(shí)診斷疾病，降低病死率以及預(yù)防和控制卡氏肺孢子菌和弓形蟲的傳播。

本發(fā)明提供一種用于卡氏肺孢子菌檢測的引物（在本發(fā)明中也稱為“引物1”），其包含：

SEQ ID No：1所示核苷酸序列或SEQ ID No：1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代、缺失和/或插入且與SEQ ID No:1具有相同功能的核苷酸序列；和/或，

SEQ ID No：2所示核苷酸序列或SEQ ID No：2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代、缺失和/或插入且與SEQ ID No:2具有相同功能的核苷酸序列。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述引物包括由SEQ ID No：1所示核苷酸序列組成的上游引物（PJ-F）和由SEQ ID No：2所示核苷酸序列組成的下游引物（PJ-R）。

本發(fā)明還提供一種用于弓形蟲檢測的引物（在本發(fā)明中也稱為“引物2”），其包含選自：