[發(fā)明專利]下調Sirt5基因表達的脂肪間充質干細胞

在審

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• 申請日: 2020-09-18
• 公開（公告）號: CN112063589A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設計）人: 葛均波;歐天童;孫愛軍;楊文龍;孫曉壘;陸儀靜
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K35/28;A61P9/10
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發(fā)明公開了一種脂肪間充質干細胞，其染色體中Sirt5基因表達下調。Sirt5基因表達下調的脂肪間充質干細胞提高了增殖能力及抗氧化力，延緩細胞衰老，可作為生物藥物用于治療下肢缺血藥物，顯示出良好的開發(fā)和應用前景。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，具體地說，涉及一種下調Sirt5基因表達的脂肪間充質干細胞及其在制備治療下肢缺血的藥物中的用途。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類經(jīng)典的成體干細胞，可通過分化、旁分泌、免疫調節(jié)等多種手段促進組織修復，因而在近幾十年受到了再生醫(yī)學的廣泛關注，MSC治療缺血性疾病也是細胞治療的研究熱點之一。在多種缺血性疾病的動物模型中，MSC治療都取得了理想的結果；然而，在臨床轉化的過程中，MSC的治療效果結論不一，在一些研究中治療效果并不明顯。而造成動物實驗和臨床試驗差異的一個重要原因是臨床應用前對MSC進行的大規(guī)模體外擴增往往導致其代謝重塑，干性耗竭，生長停滯并加速其衰老，最終影響了MSC的治療作用。因此在體外培養(yǎng)階段，對間充質干細胞進行干預以維持其細胞功能，對于改善其缺血性疾病治療能力及臨床應用前景至關重要。

目前對間充質干細胞體外培養(yǎng)過程的干預手段主要包括缺氧預處理及基因編輯，這些手段很大一部分是通過改變體外培養(yǎng)下間充質干細胞代謝模式，從而實現(xiàn)對其細胞功能的改善。SIRT5屬于第3類組蛋白去乙酰化酶，具有去乙酰化、去琥珀酰化、去丙二酰化及去戊二酰化多種轉錄后修飾作用。基于強大的蛋白修飾功能，SIRT5參與調節(jié)多個細胞代謝通路，包括糖酵解、氧化磷酸化、脂肪酸β氧化及尿素循環(huán)，并可通過改變細胞代謝模式影響細胞增殖、生存、凋亡等多種細胞過程。因此，靶向干預SIRT5表達水平可改變細胞代謝及功能。

發(fā)明內容

我們在對SIRT5功能和作用機理的研究中，提取了野生型C57BL/6小鼠的ADMSC，提取后分別轉染空白病毒或Sirt5敲減慢病毒，獲得穩(wěn)轉株后測定兩種細胞在體外連續(xù)培養(yǎng)下的增殖能力、抗氧化力及衰老程度，并將二者移植入下肢缺血模型檢測其治療能力。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt5表達下調可明顯提高ADMSC體外培養(yǎng)下的增殖能力及抗氧化力，延緩細胞衰老，提高ADMSC治療缺血下肢的血流恢復作用并增強移植后缺血組織的血管新生水平。這一重要發(fā)現(xiàn)構成了本發(fā)明的基礎，發(fā)明人成功地對脂肪間充質干細胞實施了Sirt5基因表達下調，驗證了上述結果。具體而言，本發(fā)明包括如下技術方案。

一種脂肪間充質干細胞，其染色體中Sirt5基因表達下調(或稱表達降低)。其可稱為下調Sirt5基因表達的脂肪間充質干細胞、Sirt5基因表達下調的脂肪間充質干細胞、或者Sirt5基因表達降低的脂肪間充質干細胞。

上述的Sirt5基因表達下調可以是指Sirt5基因被敲除、失活、缺失、敲減、或者表達受抑制。即，所述脂肪間充質干細胞下調表達SIRT5蛋白或者不表達SIRT5蛋白。

在一種實施方式中，Sirt5基表達下調的方法可以是用慢病毒敲減所述Sirt5基因。

上述脂肪間充質干細胞來源于人或者動物，例如來源于人體脂肪組織。

作為上述脂肪間充質干細胞來源(或稱供體)的人或者動物可以是健康的個體，也可以具有下肢缺血癥狀。這樣，間充質干細胞既可以用于異體移植，也可以用于自體移植。缺失Sirt5基因后的脂肪間充質干細胞可以注入具有下肢缺血癥狀的人或者動物體內來達到治療效果。

本發(fā)明的第二個方面提供了一種上述脂肪間充質干細胞的方法，其用慢病毒轉染脂肪間充質干細胞，得到下調Sirt5基因表達的脂肪間充質干細胞。所述慢病毒是Sirt5敲減病毒(Sirt5 KD)。

作為另一種可選的實施方式，構建下調Sirt5基因表達的脂肪間充質干細胞的方法是通過基因編輯使脂肪間充質干細胞染色體中的Sirt5基因表達下調、甚至不表達，克隆得到Sirt5基因表達下調、甚至不表達的脂肪間充質干細胞。