[發(fā)明專利]用于宮頸高級(jí)別病變和宮頸癌早期檢測(cè)的組合物及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010986280.3
• 申請(qǐng)日: 2020-09-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112048561B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉沛;王林海;王紫蕓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京起源聚禾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京同輝知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11357
• 代理人: 孫艷敏;楊敬

本發(fā)明公開(kāi)了用于宮頸高級(jí)別病變和宮頸癌早期檢測(cè)的組合物及試劑盒，用于宮頸高級(jí)別病變和宮頸癌早期檢測(cè)的組合物，包括FAM19A4基因甲基化引物、甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的探針和甲基化封閉引物，JAM3基因甲基化引物、甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的探針和甲基化封閉引物，PAX1基因甲基化引物、甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的探針和甲基化封閉引物，內(nèi)參基因GAPDH的1對(duì)引物和甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的探針。采用多重多通道熒光和封閉技術(shù)手段，通過(guò)特異性引物探針與甲基化序列準(zhǔn)確識(shí)別，加上多條封閉引物的作用將甲基化模板充分釋放出來(lái)，以及優(yōu)化的特殊的甲基化DNA聚合酶，對(duì)FAM19A4、JAM3和PAX1基因甲基化位點(diǎn)精確檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于核酸體外診斷的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種將特定的基因甲基化標(biāo)志物應(yīng)用于宮頸高級(jí)別病變和宮頸癌早期檢測(cè)的組合物及試劑盒。

背景技術(shù)

目前，宮頸癌是世界女性第四大易發(fā)癌種，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例570,000例，死亡311,000例，宮頸癌成為多數(shù)中低收入國(guó)家女性癌癥死亡的主要原因。宮頸癌病因明確，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染是必要條件，由宮頸癌前病變發(fā)展至浸潤(rùn)性宮頸癌的過(guò)程可長(zhǎng)達(dá)十年，因而早期進(jìn)行宮頸癌篩查可以有效阻斷癌前病變的進(jìn)展。近幾年宮頸癌的發(fā)病趨勢(shì)愈發(fā)年輕化，小于35歲女性發(fā)病率明顯上升，約占新發(fā)病例的30％，另有數(shù)據(jù)顯示，宮頸癌的發(fā)病率存在地理差異，農(nóng)村居民的發(fā)病率高于城市居民，我國(guó)中部地區(qū)較東、西部發(fā)病率高，這些差異可能部分歸因于缺乏對(duì)宮頸癌的有效篩查及防治措施。近年來(lái)，隨著基因檢測(cè)和基因編輯技術(shù)的發(fā)展、預(yù)防性HPV疫苗的推廣以及治療性疫苗的開(kāi)發(fā)研究，為宮頸癌早期篩查及預(yù)防指明了新的方向。

人乳頭瘤病毒(HPV，全稱為human papillomavirus)被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生最主要原因，其和宮頸癌的關(guān)系最先于在上世紀(jì)70年代的時(shí)候由德國(guó)的科學(xué)家Harald zurHausen提出的，而后得到了驗(yàn)證。據(jù)研究，HPV有多達(dá)100多種亞型，目前通常根據(jù)它的致癌性與否分為低危型和高危型：低危型的HPV通常不會(huì)導(dǎo)致惡性病變，但是高危型的HPV感染可能會(huì)最終導(dǎo)致宮頸癌前病變和宮頸癌，例如，最主要的兩種高危型HPV病毒HPV-16和HPV-18基本跟90％以上的宮頸癌相關(guān)。在通常情況下，絕大多數(shù)的HPV感染都是暫時(shí)的，約超過(guò)90％以上的感染會(huì)在2～3年里清除掉，而這被認(rèn)為要?dú)w因于人類的細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。但值得注意的是，在感染后對(duì)HPV-16病毒的抗體似乎只能起到相對(duì)普通的效果，沒(méi)能夠自發(fā)清除掉的患者在隨后的數(shù)年或數(shù)10年中有發(fā)展成為宮頸上皮內(nèi)瘤病變CIN(cervicalintraepithelial neoplasia)甚至宮頸癌的危險(xiǎn)。

早期篩查是預(yù)防宮頸癌癌前病變及宮頸癌的一種有效方法，目前臨床上常用的檢測(cè)手段主要包括液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和HPV檢測(cè)。相較于傳統(tǒng)的巴氏涂片法(靈敏度在30～87％之間，有時(shí)靈敏度甚至低于20％)，液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)具有一定的提升，但仍有一定比例的假陰性結(jié)果(有研究表明，假陰性概率約為50％)。由于持續(xù)性的高危型HPV感染是宮頸病變的首要原因，對(duì)HPV核苷酸的檢測(cè)在對(duì)宮頸病變的檢測(cè)上具有極高的靈敏度(文獻(xiàn)數(shù)據(jù)約為90％)，但由于僅有小部分的高危HPV感染患者會(huì)表現(xiàn)出宮頸病變，因而HPV檢測(cè)表現(xiàn)出極低的特異性(約為60.7％)，特別是在年輕女性中。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種修飾方式，研究報(bào)告，DNA甲基化能影響正常哺乳細(xì)胞的基因表達(dá)和沉默；同時(shí)，在人類腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化通常能導(dǎo)致腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島變化。腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化或者低甲基化都可能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而使DNA甲基化狀態(tài)成為腫瘤檢測(cè)的潛在標(biāo)志物。