[發(fā)明專利]番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787及其克隆方法與應(yīng)用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010984101.2
• 申請(qǐng)日: 2020-09-18
• 公開（公告）號(hào): CN112195178A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 欒雨時(shí);張媛媛;洪雨慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/70;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82;C12R1/19
• 代理公司: 大連格智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

1.一種番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787，其特征在于，其DNA分子序列如SEQID NO.1所示。

2.權(quán)利要求1所述番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的克隆方法，其特征在于：以野生型感晚疫病番茄早粉2號(hào)的cDNA為模板，以lncRNA40787-FP、lncRNA40787-RP為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

所述特異性引物的序列分別如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示：

將得到的PCR產(chǎn)物與pMD-18T克隆載體連接，得到的克隆載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進(jìn)行測(cè)序，所得產(chǎn)物即為番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787。

3.權(quán)利要求1所述番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的應(yīng)用方法，其特征在于，用于沉默番茄miR394，抵御病原菌侵染。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的應(yīng)用方法，其特征在于，用于提高番茄對(duì)晚疫病的抗性。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的應(yīng)用方法，其特征在于，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

將含有番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、鏈霉素及利福平的YEB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證；

選取陽(yáng)性工程菌瞬時(shí)侵染番茄葉片，并檢測(cè)葉片中miR394的表達(dá)量及葉片對(duì)晚疫病的抗性。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的應(yīng)用方法，其特征在于，還包括檢測(cè)葉片對(duì)晚疫病的抗性。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的應(yīng)用方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體由番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787插入表達(dá)載體得到。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的應(yīng)用方法，其特征在于，所述重組表達(dá)載體的具體制備過(guò)程為：

①克隆番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787：以野生型感晚疫病番茄早粉2號(hào)的cDNA為模板、以lncRNA40787-FP和lncRNA40787-RP為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物的序列分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示：將得到的PCR產(chǎn)物與pMD-18T克隆載體連接，得到的克隆載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基后，提取含有番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787菌體中的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；

②構(gòu)建含有番茄抗晚疫病長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA40787的重組表達(dá)載體：用限制性內(nèi)切酶BamHI及SacI對(duì)上述測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收得到目的片段，將所述目的片段與同樣經(jīng)BamHI及SacI雙酶切的pBI121表達(dá)載體連接，得到的表達(dá)載體連接產(chǎn)物即為重組表達(dá)載體。