[發(fā)明專利]一種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的LAMP快速檢測(cè)試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010982917.1
• 申請(qǐng)日: 2020-09-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111876511A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔清泉;馮品;張斌;劉俊麟;胡源;馬駿松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院（四川大學(xué)華西醫(yī)院西藏成辦分院）
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)的LAMP檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，屬于微生物分子檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明由于設(shè)計(jì)了高度特異性的引物(如SEQ ID NO.1～4所示)，相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的方法兼具了簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物分子檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(mycobacterium tubercu1osis，MTBC)是肺內(nèi)及肺外結(jié)核共同的病原菌，包括人結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌。目前,有超過(guò)三分之一的世界人口感染結(jié)核。根據(jù)2016年WHO全球結(jié)核調(diào)查報(bào)告顯示，2015年全球有1040萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病人，中國(guó)的新發(fā)病例僅次于印度。研究結(jié)果顯示中國(guó)潛伏期結(jié)核比例在13％～20％。中國(guó)仍是全球22個(gè)結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。現(xiàn)階段結(jié)核病控制、預(yù)防與治療最好的手段就是通過(guò)早期快速準(zhǔn)確的診斷和完善治療體系。因此，開(kāi)發(fā)可用于結(jié)核病致病菌早期實(shí)時(shí)、快速診斷技術(shù)，或許是幫助我們有效防治結(jié)核病的根本方法。

目前大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家，對(duì)結(jié)核病的診斷主要是通過(guò)觀察臨床標(biāo)本中(如痰液)是否存在結(jié)核分枝桿菌，如細(xì)菌涂片鏡檢和培養(yǎng)等，該法需要的設(shè)備簡(jiǎn)易，操作容易掌握，但存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低和特異性低等問(wèn)題，這樣很難及時(shí)診斷結(jié)核病，不利于結(jié)核病的診斷與控制。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4-6種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒溫?cái)U(kuò)增，15-60分鐘左右即可實(shí)現(xiàn)核酸有效擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測(cè)等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快捷準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的LAMP檢測(cè)試劑盒及方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案包括：

一種LAMP引物，序列如SEQ ID NO.1～4所示。

一種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的LAMP檢測(cè)試劑盒，它包括：序列如SEQ ID NO.1～4的引物。

如前述的試劑盒，它還包括：

商業(yè)化的LAMP Mix；LAMP酶、鎂離子、dNTP以及LAMP用緩沖液。

如前述的試劑盒，所述商業(yè)化的LAMP Mix與引物被混在同一個(gè)分散系中。

一種非疾病診斷目的的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)方法，它是使用如權(quán)利要求2～4任一所述試劑盒進(jìn)行LAMP檢測(cè)的方法。

如前述的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)的待檢樣本為：死亡人體來(lái)源的樣本、死亡動(dòng)物體來(lái)源的樣本或環(huán)境來(lái)源樣本。

如前述的檢測(cè)方法，它包括如下LAMP程序：60～65℃，15～60min。

如前述的檢測(cè)方法，反應(yīng)溫度是65℃恒溫。

如前述的檢測(cè)方法，反應(yīng)時(shí)間為50min。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1)特異性強(qiáng)

本發(fā)明的試劑盒和方法可以特異性檢測(cè)出樣品中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，所檢測(cè)的陰性對(duì)照細(xì)菌和水對(duì)照均無(wú)陽(yáng)性結(jié)果出來(lái)。

2)靈敏度高

本發(fā)明的試劑盒和方法的最低檢測(cè)限約為1.0×10^-3ng/μL。

3)簡(jiǎn)單快速

本發(fā)明使用“一步法”LAMP，理論上的LAMP擴(kuò)增時(shí)間為50min，這大大縮減了檢測(cè)時(shí)間。