[發明專利]一種高效的核酸檢測和基因測序方法及其裝置

有效

• 申請號: 202010982860.5
• 申請日: 2020-09-18
• 公開（公告）號: CN111926065B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 王中陽;李文文;肖康;高琪;孫靜
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海高等研究院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6837;C12M1/34;C12M1/00;G01N21/64;G16B40/00;G16B20/30;G06F17/16
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 余永莉

本發明提供一種高效的核酸檢測和基因測序方法及其裝置，該方法包括步驟：S1：構建空間和光譜定標矩陣A作為先驗信息；S2：采用熒光探針標記目標核酸序列，制備具有空間分布的核酸芯片，光源激發核酸芯片發出多色熒光信號，采用成像模塊和面陣探測器依次對多色熒光信號進行調制、編碼和采集，獲得熒光二維強度測量矩陣Y；S3：通過關聯重構算法將定標矩陣A與測量矩陣Y進行關聯計算，求解Y=AX，重構出目標信號X，即標記目標核酸序列的熒光分子空間、光譜和強度分布信息，實現高效核酸檢測和基因測序。本發明通過改變傳統光學檢測方式，提供一種核酸檢測和基因測序方法及其裝置，實現了高通量、高靈敏、快速、多重核酸檢測和基因測序。

技術領域

本發明涉及分子診斷領域，更具體地涉及一種高效的核酸檢測和基因測序方法及其裝置。

背景技術

核酸、基因檢測主要采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術，是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的技術，通過多個循環的變性、退火和延伸，能夠使微量的遺傳物質在幾小時內得到幾百萬倍的擴增，然后通過檢測PCR擴增后的熒光信號來定性或定量。PCR技術已經成為了生命科學研究和臨床分子診斷領域最重要的支撐技術和核心驅動力。PCR技術主要包括實時熒光定量PCR（qPCR）技術和數字PCR（dPCR）技術。但目前PCR技術在高準確率、低濃度的和快速檢測方面仍無法滿足快速高效的核酸檢測市場需求。商用的dPCR為了提高核酸檢測效率，采用樣本分割技術，通過制備了數萬個乃至數百萬個并行PCR反應單元，或是優化PCR反應體系、增加熒光通道數（多重PCR）來實現高通量、高靈敏的檢測。但仍然無法解決長時間的PCR反應導致的檢測效率低的問題。

基因測序是根據堿基互補配對原理來檢測生命體的核酸序列，包括DNA測序和RNA測序，目前普遍使用熒光標記的方法進行基因測序，通過對四類堿基標記四種不同的熒光基團，實現四色熒光成像，以此識別堿基。為了提高基因測序的效率，基因檢測儀也經歷了三代的發展，第二代測序儀的技術基礎是高密度基因芯片的熒光成像，其優點是通量高、成本低，缺點是在測序之前都要通過聚合酶鏈式反應（PCR）實現DNA擴增的建庫過程，這就可能引入外源的堿基突變，且二代測序技術普遍讀長較短。第三代測序技術由于不需要經PCR 建庫的過程，直接對樣本中的 DNA 分子進行測序，其潛在優點是速度快、準確率高，且有望大幅度降低成本，但限于目前的技術發展水平，測序的錯誤率還較高，且通量和成本在短時間內也無法與第二代測序技術相比。

因此，目前的核酸、基因檢測和測序技術因傳統光學檢測技術的限制仍然存在不可克服的瓶頸，主要體現在以下兩個方面：

1）多通道檢測效率：通過不同熒光染料進行標記，可獲得不同通道的數據信息，提高單一樣本的檢測類別。但是由于光學檢測手段的限制，目前市場上多通道的實現方式主要包括以下兩種檢測方式：一：采用多通道切換依次曝光檢測方式，一次只能檢測一種熒光試劑。檢測效率較低，不能滿足同時檢測多種熒光試劑的目的；二：將單通道系統機械的進行疊加或集成，用光纖連接各個獨立的檢測系統和分開的各待檢測試劑，這個檢測效率相較于單通道系統有所提升，但整個系統的體積較大，成本較高。但是，以上兩種方式都需要對多個熒光通道進行分步檢測，樣品被反復照射或者照射的時間有差異，熒光的淬滅性影響很難測定。并且不同熒光通道之間存在較大串擾和干擾，多色熒光檢測技術存在技術不足。

2）檢測時間：目前的光學檢測手段由于探測靈敏度的限制，無法避免長時間的PCR的擴增反應來實現熒光累積，也就是說，光學檢測能力決定了PCR的所需循環數。目前檢測時間較長也是由于光學檢測能力不足，導致所需的PCR循環數過多，從本質上無法滿足快速檢測的要求。因此，提高熒光探測靈敏度是實現快速PCR的重要手段，通過實現弱光檢測能力，來達到大幅減少PCR擴增循環數的需求。實現弱光探測能力，一方面可從高信噪比、高純度、高亮度熒光探針標記的樣品制備方法出發，另一方面，優化光學系統，提高熒光弱信號的探測靈敏度是更本質的解決方法。