[發(fā)明專利]一種Taq DNA聚合酶突變體Mut2及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010982425.2
• 申請(qǐng)日: 2019-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN112080482B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶俊偉;瞿志鵬;韓錦雄;曹林;張力軍;江明揚(yáng);趙芳芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京諾唯贊生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/12
• 分類號(hào): C12N9/12;C12N15/54;C12Q1/686
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 杜靜;徐冬濤

本發(fā)明公開Taq DNA聚合酶突變體Mut2及其應(yīng)用，所述突變型Taq DNA聚合酶在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三聯(lián)體表示：字母?數(shù)字?字母，其中數(shù)字表示突變氨基酸的位置，數(shù)字前的字母對(duì)應(yīng)突變涉及的氨基酸，數(shù)字后的字母表示用于置換數(shù)字前氨基酸的氨基酸：T386A，A407L，F(xiàn)413Y。本發(fā)明所述的突變體，可以通過改變酶的構(gòu)象，提高酶的耐受能力，很好的應(yīng)用于血液樣本的擴(kuò)增。

本申請(qǐng)為申請(qǐng)日為2019年10月29日，申請(qǐng)?zhí)枮?01911038688.1，發(fā)明名稱為一種Taq DNA聚合酶突變體及其應(yīng)用的中國(guó)發(fā)明專利的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Taq DNA聚合酶突變體Mut2及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

PCR技術(shù)己廣泛應(yīng)用于遺傳病分子診斷、動(dòng)植物進(jìn)出口檢疫、臨床檢驗(yàn)、食品安全監(jiān)測(cè)、親子鑒定和土壤微生物檢測(cè)等眾多領(lǐng)域。檢測(cè)的基因模板主要來自從組織、唾液、細(xì)胞、痰液、血液、便以及土壤等。血液、土壤等樣本中因?yàn)檫€有血紅蛋白、血紅素、乳鐵蛋白、IgG和腐殖酸等，這些物質(zhì)都對(duì)Taq DNA聚合酶有很強(qiáng)的抑制作用。傳統(tǒng)的方法是從這些樣本中將核酸提取出來，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于該領(lǐng)域的檢測(cè)通量越來越大，傳統(tǒng)的方法操作步驟繁多，導(dǎo)致工作效率低，耗時(shí)耗試劑，時(shí)間和財(cái)務(wù)成本高，樣本量大很容易產(chǎn)生交叉污染。因此，選擇直擴(kuò)成為一種趨勢(shì)，而不經(jīng)過核酸提取，樣本中存在很多抑制擴(kuò)增的物質(zhì)，導(dǎo)致擴(kuò)增不能正常進(jìn)行，常出現(xiàn)假陰性等結(jié)果。為此，提高擴(kuò)增試劑的耐抑制物效力成為分子生物學(xué)行業(yè)的熱門研究方向，主要是對(duì)Taq DNA聚合酶的改造方面。

Taq DNA聚合酶的編碼基因全長(zhǎng)2496個(gè)堿基，編碼832個(gè)氨基酸，全酶共分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域，Taq DNA聚合酶蛋白多肽鏈N端1-291個(gè)氨基酸構(gòu)成第一個(gè)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域表達(dá)5’-3’核酸外切酶活性；肽鏈C端424-832個(gè)氨基酸構(gòu)成第二個(gè)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域表達(dá)5’-3’聚合酶活性；位于肽鏈中間的292-423個(gè)氨基酸構(gòu)成第三個(gè)結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域與Taq DNA聚合酶的三維空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。

酶的改造和修飾主要有以下方法：基因突變、基因融合、化學(xué)修飾、抗體修飾和核酸適配體修飾等。其中在提高耐抑制能力上，主要采用基因突變方法，已經(jīng)被報(bào)告的突變位點(diǎn)很多，如：E189K、E230K、E507K、H28R、L30R、G38R、H75R、E76G、E76K、E90K、E734K、E734G、D732G、E708Q、E681M、Q680R、H676R、D578N、I553V等。針對(duì)耐抑制物的突變，如：E189K、E230K和E507K可提高Taq DNA聚合酶對(duì)SYBR Green Ⅰ dye、全血、SDS和鹽酸胍等的耐受能力；D452N、D551N可增強(qiáng)酶對(duì)肝素的耐受能力；E708Q可提供酶對(duì)SYBR Green Ⅰ dye、全血和土壤的耐受能力。從已被報(bào)道的突變可知，絕大多數(shù)突變位點(diǎn)設(shè)置在第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，通過影響5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’聚合酶活性相關(guān)的性能來實(shí)現(xiàn)Taq DNA聚合酶的改變。

抑制物主要通過干擾細(xì)胞的裂解過程、融合或降低核酸或者抑制DNA聚合酶的活性等方面來影響擴(kuò)增反應(yīng)，其中多數(shù)以抑制DNA聚合酶的活性為主。血液中的抑制物，如：血紅蛋白、乳鐵蛋白等，是通過讓Taq DNA聚合酶失活或者抑制其活性，或者捕獲/降解模板DNA和引物，從而抑制擴(kuò)增。目前很久研究都是在第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因突變，篩選能夠提高全血耐受能力的突變體，幾乎沒有關(guān)于第三結(jié)構(gòu)域的突變，對(duì)第三結(jié)構(gòu)域的研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的提供Taq DNA聚合酶突變體及其在PCR領(lǐng)域的應(yīng)用，本發(fā)明所述的Taq DNA聚合酶突變體是通過對(duì)Taq DNA聚合酶第三結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變的突變體。

本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到：