[發明專利]一種抗豬繁殖與呼吸綜合征感染的藥物及其檢測方法

在審

• 申請號: 202010979254.8
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112089804A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 畢峻龍;黃曉老;尹革芬;鄭旺華;楊培昌;王蕾;左慶威
• 申請（專利權）人: 楚雄彝族自治州動物疫病預防控制中心;景洪市畜牧技術推廣站;云南農業大學
• 主分類號: A61K36/906
• 分類號: A61K36/906;A61P31/14;G01N33/15;C12Q1/02;C12Q1/70;G01N33/68;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 張璽

1.一種抗豬繁殖與呼吸綜合征感染藥物，其特征在于，包括下列重量份的原料：

2.如權利要求1所述的一種抗豬繁殖與呼吸綜合征感染藥物，其特征在于，包括下列重量份的原料：

3.一種如權利要求1或2所述的抗豬繁殖與呼吸綜合征感染藥物的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

1)藥物提取，將10～20％重量份的大黃藤、20～30％重量份的大黃、5～15％重量份的黃連、4～10％重量份的山奈、0.1～1％重量份的重樓、3～7％重量份的紫花茉莉、1～3％重量份的金銀花、15～25％重量份的魚腥草與10～20％重量份的板藍根進行破碎，破碎后的粉末進行混勻，然后取其中一定量的混合藥物放入砂鍋中，往砂鍋內倒入適量的蒸餾水，用玻璃棒不斷攪拌，直到蒸餾水完全淹沒，用加熱砂鍋，用玻璃棒不斷攪拌，待水沸騰，沸騰10min后，用粗紗布過濾混合藥物，轉移到一號燒杯中；向混合藥物殘渣中加入適量的水，繼續加熱，沸騰后10min，用粗紗布繼續過濾，轉移到二號燒杯中；繼續向混合藥物濾渣中加入適量的水，加熱，沸騰10min后，粗紗布過濾，轉移到三號燒杯中；將一號燒杯、二號燒杯與三號燒杯內的濾液合并一起，用抽濾瓶進行抽濾，然后放入烘箱中進行濃縮，濃縮到相應的體積，計算得到藥物濃度，過濾分裝后，于4℃保存備用，得到提取藥物；

2)提取藥物對Marc-145細胞的毒性處理，獲得細胞抑制率與細胞存活率，得出提取藥物的最大無毒濃度TC₀與半數毒性濃度TC₅₀；

3)多種給藥方式評價提取藥物體外抗豬繁殖與呼吸綜合征效果，獲得各種給藥方式的提取藥物的半抑制濃度；

4)多種給藥方式對病毒毒力的影響，獲得各種給藥方式的提取藥物的50％組織細胞感染量；

5)提取藥物對病毒ORF7基因mRNA表達的影響，RT-qPCR特異性檢測引物的設計與合成；不同有效濃度提取藥物與不同給藥方式作用豬繁殖與呼吸障礙綜合征后病毒ORF7基因mRNA的表達變化；RNA提取；RNA定量、反轉錄和qPCR；

6)提取藥物對豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒單抗蛋白表達的影響；

7)提取藥物在臨床上的實驗，通過臨床上的實驗觀察提取藥物對豬繁殖與呼吸障礙綜合征感染豬仔臨床體征與病理變化影響，然后進行提取藥物對肺臟組織中豬繁殖與呼吸障礙綜合征ORF7基因的表達變化影響，提取藥物對肺臟組織中豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒單抗蛋白表達的影響，通過IHC檢測豬繁殖與呼吸障礙綜合征在肺臟組織中的表達，獲得提取藥物的檢測結果。

4.如權利要求3所述的一種抗豬繁殖與呼吸綜合征感染的藥物檢測方法，其特征在于：所述步驟3)中多種給藥方式包括預防作用給藥、治療作用給藥與直接滅殺作用給藥。

5.如權利要求3所述的一種抗豬繁殖與呼吸綜合征感染的藥物檢測方法，其特征在于：所述步驟4)中多種給藥方式包括預防作用給藥、治療作用給藥與直接滅殺作用給藥。

6.如權利要求3所述的一種抗豬繁殖與呼吸綜合征感染的藥物檢測方法，其特征在于，所述步驟5)中RNA定量、反轉錄和qPCR包括下列步驟：a)總RNA濃度及純度測定；b)將提取的RNA反轉錄為cDNA；c)將反轉錄產物cDNA作為qPCR的模板，用來擴增ORF7基因與GAPDH基因。

7.如權利要求3所述的一種抗豬繁殖與呼吸綜合征感染的藥物檢測方法，其特征在于：所述步驟7)中提取藥物對肺臟組織中豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒單抗蛋白表達的影響，進行采集豬的肺臟，然后通過蛋白質印跡法檢測肺臟組織中豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒單抗蛋白表達。

8.如權利要求7所述的一種抗豬繁殖與呼吸綜合征感染的藥物檢測方法，其特征在于，所述蛋白質印跡法檢測肺臟組織中豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒單抗蛋白表達包括以下步驟：

1)蛋白樣品的制備；

2)SDS-PAGE電泳與轉膜；

3)抗體孵育；

4)化學發光與顯影。