[發明專利]利用MPP1基因評估綿羊卵母細胞體外培養體系的方法

在審

• 申請號: 202010979195.4
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112063657A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 曹鴻國;陶金萍;周銘生;陳宏權;周建軍
• 申請（專利權）人: 安徽省天長市周氏羊業有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 合肥市道爾知識產權代理有限公司 34169
• 代理人: 石佩

1.利用MPP1基因評估綿羊卵母細胞體外培養體系的方法，其特征在于，所述MPP1基因，為綿羊X染色體的分子標記基因MPP1，所述MPP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的利用MPP1基因評估綿羊卵母細胞體外培養體系的方法，其特征在于，所述MPP1基因，具體為綿羊Chromosome X-NC_040278.1的MPP1基因。

3.根據權利要求1所述的利用MPP1基因評估綿羊卵母細胞體外培養體系的方法，其特征在于，選擇綿羊X染色體的MPP1基因的啟動子區域設計基因擴增引物。

4.根據權利要求1所述的利用MPP1基因評估綿羊卵母細胞體外培養體系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、綿羊卵巢組織DNA基因組的提?。喝【d羊卵巢組織，打碎形成細胞懸液，并利用DNA提取試劑盒，制得綿羊卵巢組織DNA基因組；

S2、綿羊MPP1基因啟動子的擴增：利用Vector NTI Advance 11.5.1軟件，對綿羊MPP1基因啟動子擴增引物進行設計，經添加酶切位點、保護堿基后，進行引物合成，并采用PCR擴增，再采用瓊脂糖凝膠電泳回收MPP1基因啟動子序列，制得綿羊MPP1基因啟動子序列，啟動子序列測序后選擇MPP1基因啟動子擴增正確的序列；

S3、MPP1基因啟動子pLV-mCherry重構載體的構建：分別用限制性內切酶Cla I和BamHI酶切綿羊MPP1基因啟動子序列和pLV-mCherry載體，并采用瓊脂糖凝膠電泳分別回收MPP1基因啟動子序列和pLV-mCherry載體，再用T4連接酶連接MPP1基因啟動子序列和pLV-mCherry載體，構建MPP1基因啟動mCherry表達的pLV-mCherry重構載體；利用綿羊MPP1基因啟動子鑒定引物對含上述重構載體的菌體進行PCR鑒定，以檢測MPP1基因啟動子pLV-mCherry重構載體構建是否正確；

S4、介導MPP1基因啟動子-mCherry轉染病毒包裝：利用細胞培養體系包裝轉染pLV-MPP1基因啟動子-mCherry質粒的病毒，并收集包裝病毒培養液；

S5、綿羊卵巢組織的體外培養：取綿羊的卵巢組織，分離剝取卵巢初級卵泡，在培養皿微滴中培養卵巢初級卵泡，并置于37℃含5％CO₂的飽和濕度培養箱中培養，待卵巢初級卵泡貼壁后，采用包裝病毒介導的MPP1基因啟動子-mCherry表達轉基因技術；

S6、MPP1基因啟動子-mCherry的表達：將S4收集到的包裝病毒培養液，經離心、過濾、重懸后，加入感染增強劑Polybrene，混勻制得含MPP1基因啟動子-mCherry的病毒感染液；將S5制得的卵巢初級卵泡貼壁的培養微滴，吸棄其中卵泡培養液，添加上述制得的含MPP1基因啟動子-mCherry的病毒感染液進行感染培養，再吸棄含MPP1基因啟動子-mCherry的病毒感染液，添加卵泡培養液培養，根據卵巢初級卵泡mCherry紅色熒光蛋白表達情況，挑選強表達紅色熒光蛋白的卵巢初級卵泡進行卵母細胞微滴成熟培養；根據卵母細胞mCherry紅色熒光蛋白表達水平的高低，結合綿羊卵巢初級卵泡和卵母細胞生長發育情況，即可評估綿羊卵母細胞體外培養的體系，完成利用分子標記基因MPP1評估綿羊卵母細胞體外培養體系的整個過程。

5.根據權利要求4所述的利用MPP1基因評估綿羊卵母細胞體外培養體系的方法，其特征在于，添加酶切位點前的綿羊MPP1基因啟動子擴增引物，其上游擴增引物、下游擴增引物的核苷酸序列分別為：

上游引物F：5’-ACTTTGTTATAGGTTGCGCG-3’；

下游引物R：5’-TCATCTTATGGGAGAGCCGG-3’；

所述MPP1基因啟動子的基因序列長度為2008bp。