[發明專利]一種高效的細胞毒性T淋巴細胞激活增殖制備方法

有效

• 申請號: 202010977319.5
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112175903B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 楊罕聞
• 申請（專利權）人: 藍蓮（杭州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 杭州中港知識產權代理有限公司 33353
• 代理人: 張曉紅

一種高效的細胞毒性T淋巴細胞激活增殖制備方法，屬于免疫治療技術領域。包括:1）采集健康單個核細胞；2）調整細胞濃度,孵育,收集未貼壁細胞；3）調整細胞濃度,加入A磁珠和B磁珠與懸浮細胞混合；4）將混合懸液的上清液過濾，為CTL細胞激活液；5）取患者單個核細胞，用AIM?V培養液調整濃度，孵育；6）孵育后，收集洗滌細胞，分離得到CTL細胞；7）將CTL細胞調整濃度,孵育；8）孵育結束后離心收集所有CTL細胞。上述一種高效的細胞毒性T淋巴細胞激活增殖制備方法，培養出的CTL細胞純度可達99%以上，14天內的增殖倍率在1200倍以上。

技術領域

本發明屬于免疫治療技術領域，具體為一種高效的細胞毒性T淋巴細胞激活增殖制備方法。

背景技術

細胞毒性T淋巴細胞是腫瘤免疫的主要效應細胞之一。現有傳統CTL細胞培養主要使用IL-2細胞因子，在CD3單克隆抗體的刺激下進行體外增殖培養，其細胞增殖率低下，耗費時間長。體外大規模的高效制備被樹突狀細胞誘導的CTL細胞有助于治療癌癥。

發明內容

針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在于設計提供一種高效的細胞毒性T淋巴細胞激活增殖制備方法的技術方案，其通過模擬人自身體內環境，安全有效的激活CTL細胞，極大增加了CTL細胞的增殖率，培養出的CTL細胞純度可達99%以上，14天內的增殖倍率在1200倍以上。本發明相較于傳統方法極大地縮短了培養CTL細胞的時間和成本。

所述的一種高效的細胞毒性T淋巴細胞激活增殖制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）準備健康人外周血200-400ml，使用白細胞分離液去除紅細胞、血小板和粒細胞，采集單個核細胞，臺盼藍染色計數，得到單個核細胞的數量；

2）用含有5%人白蛋白的AIM-V培養基重懸單個核細胞，調整細胞濃度為0.5x10^6/ml- 1.5 x10^6/ml，轉移到組織培養瓶中；在37攝氏度5%二氧化碳培養箱中孵育1.8-2.2小時，孵育結束后洗滌收集未貼壁細胞，臺盼藍染色計數未貼壁細胞；

3）將收集的未貼壁細胞用含有5%人白蛋白的AIM-V培養基重懸并調整細胞濃度為1x10^6 /ml，并加入A磁珠和B磁珠與懸浮細胞混合；懸浮細胞、A磁珠、B磁珠的體積比為0.8-1.2:0.6-1.0:0.1-0.3；所述的A磁珠為人類T細胞激活磁珠CD3/CD28，所述的B磁珠為人類T細胞激活磁珠CD3/CD28/CD137；

4）將細胞與磁珠的混合懸液轉移到組織培養瓶中，在37攝氏度5%二氧化碳培養箱中孵育70-74小時；孵育結束后，離心去除所有細胞與磁珠，將上清液用0.22微米濾芯過濾除菌，過濾后保存，將其命名為CTL細胞激活液；

5）采用常規方法配置含有50%的CTL細胞激活液，2%自體血清和48%的AIM-V培養液；取患者1x10^8個單個核細胞，用AIM-V培養液調整到8x10^6 /ml，轉移到組織培養瓶中；在37攝氏度5%二氧化碳培養箱中孵育22-24小時；

6）孵育結束后，收集洗滌細胞，用人類陰性CD8細胞分離試劑盒分離得到CTL細胞；

7）采用常規方法制備10% CTL細胞激活液、10%自體血清、80%AIM-V培養液，將步驟6）分離得到的CTL細胞調整到0.5x10^6 /ml-1.5 x10^6/ml，在37攝氏度5%二氧化碳培養箱中孵育13-15天；每隔三天加入與現有培養液的量同等的10% CTL細胞激活液、10%自體血清、80%AIM-V培養液；

8）孵育結束后離心收集所有CTL細胞，即為最終產品細胞毒性T淋巴細胞。

所述的一種高效的細胞毒性T淋巴細胞激活增殖制備方法，其特征在于步驟2）中：用含有5%人白蛋白的AIM-V培養基重懸單個核細胞，調整細胞濃度為0.8 x10^6-1x10^6 /ml。