[發明專利]一種基于G四鏈體分子信標雙酶級聯等溫擴增的檢測目的miRNA的方法

有效

• 申請號: 202010975612.8
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112080552B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 蔣宇揚;譚英;陳俊粵;譚春燕
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳國際研究生院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/682
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

1.一種檢測目的miRNA的方法，包括如下步驟：

(1)取含有miRNA、反應緩沖液、DNA聚合酶、核酸外切酶和G4MB的反應體系，孵育；

(2)完成步驟(1)后，檢測熒光強度；

根據熒光強度判斷miRNA中是否含有目的miRNA或目的miRNA的含量；

G4MB從5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；

DNA片段1由1個5’端磷酸化并修飾熒光基團的dT和富G序列1組成；富G序列1為GGGACGGG；

DNA片段2的核苷酸序列與miRNA的核苷酸序列反向互補；

DNA片段3由1個3’端修飾淬滅基團的dA和富G序列2組成；富G序列2為GTGGAGGG；

DNA片段1和DNA片段3由于都存在富G序列在分子內形成綁定的G四鏈體結構；

所述DNA聚合酶作用于與G4MB的3’末端結合的引物，將引物進行延伸，形成雙鏈DNA；

所述核酸外切酶作用于雙鏈DNA，逐步切去單核苷酸，且不能從DNA的切刻或缺口處起始消化；

G4MB的5’端具有磷酸基團，3’端具有引物結合位置，且以打開的G4MB為模板，通過引物和DNA聚合酶引發合成雙鏈雜合結構；

所述DNA聚合酶為Bsu?DNA聚合酶；

所述核酸外切酶為Lambda核酸外切酶；

所述方法用于非疾病的診斷與治療。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述反應體系還含有核糖核酸酶抑制劑。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述反應緩沖液為含40-60mM?NaCl、15-25mM?MgCl₂、15-25mM?KCl、130-170mM?NH₄Cl和0.8-1.2mM?DDT的pH7.8-8.0、15-25mM?Tris-HCl緩沖液。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，孵育為35-39℃孵育20min-3h。

5.如權利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：當檢測N個目的miRNA時，需要加入N個G4MB且各個G4MB的熒光標記完全不同；N為1以上的自然數。

6.DNA聚合酶、核酸外切酶、G4MB和反應緩沖液在檢測目的miRNA中的應用；

G4MB從5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；

DNA片段1由1個5’端磷酸化并修飾熒光基團的dT和富G序列1組成；富G序列1為GGGACGGG；

DNA片段2的核苷酸序列與miRNA的核苷酸序列反向互補；

DNA片段3由1個3’端修飾淬滅基團的dA和富G序列2組成；富G序列2為GTGGAGGG；

DNA片段1和DNA片段3由于都存在富G序列在分子內形成綁定的G四鏈體結構；

所述反應緩沖液為含40-60mM?NaCl、15-25mM?MgCl₂、15-25mM?KCl、130-170mM?NH₄Cl和0.8-1.2mM?DDT的pH7.8-8.0、15-25mM?Tris-HCl緩沖液；

G4MB的5’端具有磷酸基團，3’端具有引物結合位置，且以打開的G4MB為模板，通過引物和DNA聚合酶引發合成雙鏈雜合結構；

所述DNA聚合酶為Bsu?DNA聚合酶；

所述核酸外切酶為Lambda核酸外切酶；

所述應用用于非疾病的診斷與治療。