[發明專利]一種用于檢測豬流行性腹瀉病的NASBA-ELISA檢測引物及探針

在審

• 申請號: 202010974474.1
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112011536A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 王隆柏;周倫江;陳秋勇;吳學敏;車勇良;陳如敬;劉玉濤
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6844;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明涉及一種用于檢測豬流行性腹瀉病的NASBA?ELISA檢測引物及探針，根據變異豬流行性腹瀉病毒的N基因片段，合成引物和生物素探針，采用DIG?11?UTP核苷酸代替檢測地高辛探針，建立了NASBA?ELISA檢測方法。采用所述引物與探針建立的NASBA?ELISA檢測方法，與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬圓環病毒2型和豬偽狂犬病毒沒有交叉反應，能檢測到4.3pg病毒核酸，具有很好的特異性、敏感性和重復性。本發明方法一次性檢測量大、不需要特殊昂貴的儀器及高要求的技術含量，適合基層從業人員對豬流行性腹瀉疾病的快速診斷，對有效診斷與防控豬流行性腹瀉病毒具有重要意義。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測豬流行性腹瀉病的NASBA-ELISA檢測引物及探針，屬于動物傳染病學領域。

背景技術

豬流行性腹瀉（PED)是由冠狀病毒屬PEDV引起的以食欲下降、腹瀉、嘔吐和脫水為特征的豬急性腸道傳染病。2010年下半年以來，由于PEDV變異，導致該病再次席卷全球，給養豬業造成重大的經濟損失。PEDV屬于尼多病毒目、冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，編碼S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白等4種主要結構蛋白。其中N蛋白由 441個氨基酸組成，具有高度保守，含 6-7個潛在的磷酸化位點。N蛋白是病毒的主要免疫蛋白之一，能夠誘導機體產生特異性的抗體免疫和細胞免疫，豬在早期感染PEDV，可產生抗N蛋白的高水平抗體，使其成為早期診斷的靶蛋白。

由于豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒、博卡病毒在流行病學、臨床癥狀和病理表現極其相似，因此本病依據臨床、病理變化和流行病學很難做出診斷，特別是與豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒不易區別，必須依靠實驗室檢測技術才能作出確診。目前，已建立PEDV診斷方法有病毒分離、RT-PCR、熒光定量RT-PCR方法、免疫電鏡(IEM)、免疫熒光(IF)等。PEDV比較難分離，必須添加適量胰酶才有可能分離到病毒，敏感度不高，且操作煩瑣，周期較長；常規RT-PCR檢測方法雖簡單、方便、快速，但仍存在假陽性和PCR污染的問題；實時熒光RT-PCR ( real-time RT-PCR)檢測方法對儀器設備和技術含量要求較高，且價格比較昂貴；免疫電鏡(IEM)和免疫熒光(IF)檢測方法，操作比較復雜，對儀器要求比較高，同時要求檢測人員要有較強的經驗。因此，以上若干檢測方面，對于人才、技術比較薄弱的基層從業人員，同時檢測診斷較多的臨床樣品，比較困難。

依賴核酸序列的擴增( nucleuic acid sequence based amplification ,NASBA) 是在PCR 基礎上發展起來的一種新技術，該項技術由1對帶有T7啟動子序列的引物引導的連續、等溫、基于酶反應的核酸擴增技術，反應在41-42℃條件下進行，可在2 h內將模板RNA擴增10⁹倍，敏感性比常規PCR法高10³倍，而且不需特殊儀器，是一種快速﹑簡便﹑特異的擴增技術，具有敏感性高、特異性好、操作簡單等特點，很適合基層獸醫部門推廣應用。本發明則根據變異豬流行性腹瀉的N基因片段，設計合成引物和探針，建立了一種檢測豬流行性腹瀉的NASBA-ELISA病原檢測方法，適用于對基層對多樣品的快速診斷。

發明內容

本發明主要是通過設計合成PEDV的 NASBA-ELSIA病原檢測方法的引物和生物素捕獲探針，經過系列條件優化，建立了NASBA-ELSIA病原檢測方法。目的在于克服現有檢測技術的不足，而提供一種快速、簡便、敏感性高、特異性強的能解決基層從業人員診斷和防控PEDV難的問題，減少豬群的發病率和死亡率，提高養殖效益。

為實現上述目的，采用以下技術方案：