[發明專利]熒光蛋白和/或偶聯蛋白單克隆抗體標記方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 202010972671.X
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112098640B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 張洋
• 申請（專利權）人: 浙江正熙生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 尉月麗

1.一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，所述的標記方法包括以下步驟：

(1)熒光蛋白和/或偶聯蛋白經脫鹽處理后與巰基封閉劑發生反應，所述的巰基封閉劑為NEM；

(2)步驟(1)得到的巰基封閉的熒光蛋白和/或偶聯蛋白的氨基與交聯劑A發生反應，所述的交聯劑A為S-SMCC；

(3)單克隆抗體的巰基化反應，所述的單克隆抗體的巰基化反應包括單克隆抗體與交聯劑B的反應，及單克隆抗體-交聯劑B與二硫鍵還原劑的還原反應，所述的交聯劑B為S-LC-SPDP，所述的二硫鍵還原劑為TCEP；

(4)步驟(3)得到的巰基化的單克隆抗體與步驟(2)得到的交聯熒光蛋白和/或偶聯蛋白進行定向偶聯反應，反應完全后，經NEM、Cys及PBS處理步驟，得到熒光標記抗體。

2.根據權利要求1所述的一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，所述的熒光蛋白和/或偶聯蛋白包括PERCP、PE、PECy5、PECy5.5、PECy7、PerCPCy5.5、APCCy5.5、APCCy7或者APC。

3.根據權利要求1所述的一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，步驟(1)中所述的脫鹽處理包括以下步驟：

1)將熒光蛋白和/或偶聯蛋白懸濁液震蕩混合均勻，離心，去上清；

2)向沉淀中加入含有EDTA的PBS緩沖液，待充分溶解后離心，取上清；

3)將上清液移至超濾管內，采用含有0.25mM EDTA的PBS緩沖液對上清液進行超濾處理，獲得脫鹽后的熒光蛋白和/或偶聯蛋白。

4.根據權利要求1所述的一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，步驟(1)中所述的熒光蛋白和/或偶聯蛋白與所述的巰基封閉劑的摩爾比為1:3-1:1000；所述的熒光蛋白和/或偶聯蛋白與所述的巰基封閉劑的反應條件為25℃反應1.5h。

5.根據權利要求1所述的一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，步驟(2)中所述的巰基封閉的熒光蛋白和/或偶聯蛋白與所述的交聯劑A的摩爾比為1:5-1:100；所述的巰基封閉的熒光蛋白和/或偶聯蛋白與所述的交聯劑A的反應條件為25℃反應1.5h。

6.根據權利要求1所述的一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，步驟(3)中所述的單克隆抗體與所述的交聯劑B的摩爾比為1:10-1:50；所述的單克隆抗體與所述的交聯劑B的反應條件為25℃反應1h。

7.根據權利要求1所述的一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，步驟(3)中所述的二硫鍵還原劑與單克隆抗體-交聯劑B的反應終濃度為10-50mM；所述的單克隆抗體-交聯劑B與二硫鍵還原劑的反應條件為25℃反應1.5h。

8.根據權利要求1所述的一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，步驟(4)中所述的步驟(3)得到的巰基化的單克隆抗體與步驟(2)得到的交聯熒光蛋白和/或偶聯蛋白的摩爾比為1:0.5-1:100；步驟(4)中所述的步驟(3)得到的巰基化的單克隆抗體與步驟(2)得到的交聯熒光蛋白和/或偶聯蛋白的反應條件為25℃反應3h。

9.根據權利要求1-8任一項所述的一種熒光蛋白和/或偶聯蛋白與單克隆抗體的標記方法，其特征在于，

步驟(1)中所述的熒光蛋白和/或偶聯蛋白與所述的巰基封閉劑的摩爾比為1:50；

步驟(2)中所述的巰基封閉的熒光蛋白和/或偶聯蛋白與所述的交聯劑A的摩爾比為1:20；

步驟(3)中所述的二硫鍵還原劑與單克隆抗體-交聯劑B的反應終濃度為20mM；

步驟(4)中所述的步驟(3)得到的巰基化的單克隆抗體與步驟(2)得到的交聯熒光蛋白和/或偶聯蛋白的摩爾比為1:5。