[發明專利]一種精準定量檢測轉基因耐除草劑大豆ZH10-6的方法

在審

• 申請號: 202010972527.6
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112063743A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 王一衡;趙新;劉雙;尉萬聰;蘭青闊;王永
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明公開了一種精準定量檢測轉基因耐除草劑大豆ZH10?6的方法，它是采用一對特異性的引物、帶有熒光標記的探針及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在PCR反應前由微滴發生器將PCR體系分配到足夠小的反應單元中，實現每個反應單元只有單個模板分子，在60℃左右對核酸進行PCR擴增，再采用泊松分布原理，根據陽性微滴與陰性微滴數的比例計算目標分子拷貝數，實現絕對定量分析，無需標準品，無需構建標準曲線。其結果鑒定通過微滴讀取器讀取陽性微滴以及陰性微滴的個數，并以外源基因與內標準基因拷貝數濃度的比值計算樣品的轉基因含量和轉化體拷貝數。本發明的檢測方法具有精準定量、高特異性、高靈敏度、快速、簡便等優點。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，特別是涉及一種轉基因產品的精準定量檢測方法，具體說是一種基于數字PCR的轉基因大豆ZH10-6精準定量檢測方法，通過將體系溶液生成微滴，將PCR體系分配到足夠小的反應單元中，實現每個反應單元只有單個模板分子，經PCR反應擴增后，由微滴讀取器讀取微滴并計算內外基因拷貝數濃度比值，實現精準定量檢測轉基因大豆ZH10-6的方法構建及其應用。

背景技術

轉基因作物的發展突飛猛進，很多國家和地區均實施了標識管理措施，并設定了閾值。如歐盟等國實施強制性的轉基因標簽制度；美國和加拿大實施自愿性的轉基因標簽制度，我國目前對轉基因產品實施強制標識制度，對轉基因產品精準定量檢測方法的研制至關重要。目前，轉基因檢測的方法主要是基于核酸檢測的聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）技術、核酸雜交技術和基因芯片技術；基于蛋白質檢測的WesternBlot、酶聯免疫吸附測定等。其中應用最廣泛的是基于核酸檢測的普通PCR方法和實時熒光PCR方法。我國已經研制了ZH10-6大豆的定性PCR檢測方法標準，但是其數字PCR定量方法未見報道。相對于轉基因成分定性PCR檢測方法，定量PCR檢測方法不僅可以檢測產品含有的轉基因成分，而且可以確定轉基因成分的含量，更加有助于轉基因產品的行政監管。

數字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）是近年來在實時熒光PCR基礎上發展起來的微量DNA分子定量檢測新技術。dPCR是將PCR體系分配到足夠小的反應單元中，實現每個反應單元只有單個模板分子進行PCR擴增，再采用泊松分布原理，根據陽性微滴與陰性微滴數的比例計算目標分子拷貝數，實現絕對定量。該方法降低了標準曲線對測量結果產生影響等問題，降低了基體效應，實現了PCR擴增的樣品分離，消除了本底信號的影響，提高了低拷貝DNA的擴增靈敏度。相比實時熒光PCR，數字PCR 具有更好的測量獨立性，且無需任何校準物，具有更高的特異性、靈敏度、精確性和穩定性。

轉基因耐除草劑大豆ZH10-6是由中國農業科學院作物科學研究所研發的轉G2-EPSPS基因和GAT基因耐除草劑大豆新品系。研發人采用農桿菌介導轉化法，將整合有G2-EPSPS和GAT兩個基因的獨立表達載體DNA導入大豆受體中，通過多代篩選獲得對草甘膦具有抗性的ZH10-6轉化體，在我國具有重要產業化應用前景。本研究以ZH10-6轉化體特異性序列為靶標，通過對引物探針濃度的優化確定了擴增體系，并對其特異性、靈敏度、準確度等進行測試，建立了微滴式數字PCR精準定量PCR檢測方法，旨在為該轉化體的安全評價、行政監管和知識產權保護提供重要的技術支撐。

發明內容

本發明克服了定性PCR檢測轉基因大豆ZH10-6技術只可定性無法定量的缺陷，提供一種精準定量檢測轉基因大豆ZH10-6的方法。本發明的目的是解決定量檢測轉基因大豆ZH10-6方法空缺的問題，具有快速、高效、精準定量檢測等優勢。

本發明的技術內容如下：

一種用于檢測轉基因大豆ZH10-6的特異性引物及探針，其特征在于包括ZH10-6后一個插入位點5’端外源基因側翼序列：