[發(fā)明專利]一種利用Transwell構(gòu)建小鼠腸道上皮體外單層培養(yǎng)及表征方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010972462.5
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112111445A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦玉梅;郭慶斌;毛岳忠;田師一;韓劍眾
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工商大學(xué)
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/071;C12Q1/02;G01N27/04;G01N23/20;G01N23/04
• 代理公司: 浙江千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

1.一種利用Transwell構(gòu)建小鼠腸道上皮體外單層培養(yǎng)，其特征在于所述的培養(yǎng)方法包括以下幾個步驟：

步驟一、腸道隱窩結(jié)構(gòu)分離：收集8周大ICR小鼠小腸7-8cm，使用含冰上預(yù)冷的無鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液的10ml注射器清洗至清洗液中無肉眼可見殘渣；將腸道沿縱軸剖開放入冰上放置的含無鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液的100mm培養(yǎng)皿1中，使用眼科剪將腸道剪成0.5-1cm的腸段，將剪好腸段轉(zhuǎn)移至含有10ml冰上預(yù)冷的無鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液的15ml離心管1中，將離心管1上下顛倒10-20次，隨后靜置至腸段沉于離心管1底部后去除上清，按照上述方法反復(fù)清洗3次去除上清；將清洗的組織轉(zhuǎn)移至含有20ml濃度為5mM的乙二胺四乙酸溶液的50ml離心管2中；將50ml離心管2置于37℃氣浴搖床250rpm轉(zhuǎn)速振蕩10分鐘進行消化；消化結(jié)束后將離心管2中乙二胺四乙酸溶液去除，加入冰上預(yù)冷的無鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液清洗腸道組織一次后去除溶液，向離心管2中加入10ml新的磷酸鹽緩沖液手動上下振蕩離心管2，靜置至腸段沉于離心管2底部后去除離心管2中上清，再向離心管2中加入20ml冰上預(yù)冷的無鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液，手動用力振蕩離心管2 40-50次，同樣靜置后將上清通過100微米孔徑細(xì)胞篩轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管3中；離心管3以20g轉(zhuǎn)速在4攝氏度下離心10分鐘，離心結(jié)束后去除離心管3中上清，向離心管3中加入1ml培養(yǎng)基1，隨后置于冰上備用；

步驟二、復(fù)合凝膠處理Transwell嵌套：按照體積比1:30的比例將復(fù)合凝膠和冷的無鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液稀釋到1.5ml離心管4中，置于冰上備用；向含有Transwell的嵌套的24培養(yǎng)板1中嵌套的上表面加入100微升離心管4中稀釋液，隨后將培養(yǎng)板1放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱靜置孵育2h，孵育結(jié)束后去除培養(yǎng)板1嵌套上表面溶液備用；

步驟三、肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞接種：將復(fù)合凝膠處理好的Transwell嵌套從培養(yǎng)板1轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板2中，Transwell嵌套翻轉(zhuǎn)倒置，嵌套下表面朝上，隨后將100微升濃度為每毫升10⁵個細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板2中的嵌套下表面，將培養(yǎng)板2置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱靜置孵育2h；孵育結(jié)束后將Transwell嵌套重新正置轉(zhuǎn)移至新的24孔培養(yǎng)板3中，然后向嵌套下室加入500毫升培養(yǎng)基2，備用；

步驟四、腸道上皮體外單培養(yǎng)：取步驟一中獲得的含有腸道隱窩的離心管3中溶液200微升，接種于步驟三中接種過肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)板3中的嵌套的上室中，隨后將培養(yǎng)板3置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每天更換一次Transwell嵌套上、下室的培養(yǎng)基1和2。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于步驟一、四中所述培養(yǎng)基1由50％體積比例的Wint3a條件培養(yǎng)基、5％體積比例的R-spondin條件培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、表皮生長因子、神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)補充劑N2和B27、煙酰胺、Rho相關(guān)形成蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶卷曲螺旋抑制劑Y27632組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于步驟二中所述復(fù)合凝膠由粘連蛋白和膠原蛋白I組成。

4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于步驟三、四中所述培養(yǎng)基2由DMEM高糖培養(yǎng)基、非必須氨基酸溶液、青霉素、鏈霉素組成。

5.一種利用Transwell構(gòu)建小鼠腸道上皮體外單層表征方法，其特征在于所述的表征方法包括以下幾個步驟：

步驟一、腸道上皮體外單層培養(yǎng)物跨膜電阻測定：使用電阻儀每天定時記錄權(quán)利要求1中步驟4中培養(yǎng)板3中Transwell嵌套上、下室之間跨膜電阻值，跨膜電阻值計算公式為：

跨膜電阻值＝(含腸道單層培養(yǎng)物電阻儀數(shù)值-無腸道單層培養(yǎng)物對照電阻儀數(shù)值)×膜有效面積；

步驟二、腸道上皮體外單層培養(yǎng)物免疫組化：權(quán)利要求1步驟四中培養(yǎng)板3中Transwell嵌套上培養(yǎng)到第4天腸道上皮，將嵌套聚碳酸脂膜用解剖刀從Transwell嵌套上分離，并在膜的左上角做好標(biāo)記，用于區(qū)分聚碳酸脂膜上下表面，隨后將膜迅速放入含有2ml濃度為4％的多聚甲醛溶液的15毫升離心管5中固定15分鐘；去除離心管5中多聚甲醛溶液，隨后免疫組化專用磷酸鹽緩沖液清洗膜三次，每次5分鐘；清洗結(jié)束后向離心管5中加入1ml含待檢測一抗的封閉液，4℃冰箱靜置放置12小時；隨后磷酸鹽緩沖液重復(fù)清洗3次，每次5分鐘，清洗完畢后加入與一抗來源相對應(yīng)二抗，室溫24℃條件下靜置孵育30分鐘；孵育后磷酸鹽緩沖液重復(fù)清洗4次，每次5分鐘；清洗后加入2-(4-脒基苯基)-6-吲哚脒二鹽酸鹽溶液室溫靜置5分鐘，超純水重復(fù)清洗兩次，每次5分鐘；最后將嵌套聚碳酸脂膜轉(zhuǎn)移至載玻片上，膜上表面在上，加入封片液后蓋玻片封片獲得腸道上皮單層培養(yǎng)無封片；使用激光共聚焦顯微鏡對封片進行觀察，獲取免疫組化圖像；

步驟三、腸道上皮體外單層培養(yǎng)物電鏡分析：將權(quán)利要求1步驟四中培養(yǎng)板3中含有培養(yǎng)到第4-5天腸道上皮單層培養(yǎng)物的Transwell嵌套聚碳酸脂膜，用解剖刀從Transwell嵌套上分離后平均分成兩份，并在膜的左上角標(biāo)記用于區(qū)分上、下表面；將分離的嵌套膜分別放于含有1ml戊二醛的1.5毫升離心管6和7中，4℃條件下過夜；去除固定液，使用濃度為0.1M(pH7.0)磷酸鹽緩沖液清洗樣品3次，每次15分鐘，清洗結(jié)束后加入1％鋨酸溶液固定樣品1-2h；再次清洗樣品3次，后用30％，50％，70％，80％，90％和95％六種濃度的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100％的乙醇處理一次，20min，最后，再換新的100％乙醇，樣品放置在100％乙醇備用；隨后離心管6中樣品經(jīng)過干燥、鍍膜處理后使用掃面電鏡觀察腸道單層培養(yǎng)物表面特征；離心管7中樣品經(jīng)過Spurr包埋劑和丙酮混合液及純包埋劑70℃條件下過夜處理后，使用切片機獲得厚度70-90納米腸道上皮單層切片，切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50％乙醇飽和溶液各染色5-10后，透射電鏡觀察獲得圖像；

步驟四、腸道上皮體外單層培養(yǎng)通透性分析：異硫氰酸酯標(biāo)記分子量為4.4kDa葡聚糖作為示蹤劑檢測腸道單層培養(yǎng)通透性，使用不含粉紅的DMEM培養(yǎng)基清洗權(quán)利要求1步驟四培養(yǎng)板3中含有培養(yǎng)到第4-5天腸道上皮單層培養(yǎng)物的Transwell嵌套聚碳酸脂膜；然后轉(zhuǎn)移至新的多孔培養(yǎng)板4中，向嵌套的上室中加入200微升濃度為5毫克每毫升的葡聚糖溶液，下室中加入600微升不含粉紅DMEM溶液，培養(yǎng)板4整個過程中置于37℃條件下，并且分別于固定時間點從下室中使用移液槍采集100微升分析樣品至新的離心管8中，并用相應(yīng)體積不含酚紅DMEM培養(yǎng)基補全溶液；隨后使用酶標(biāo)儀在495nm激發(fā)和520nm發(fā)射波長下測量離心管8樣品中的熒光，并通過預(yù)先建立的已知濃度的校準(zhǔn)曲線進行定量計算，計算公式為：

葡聚糖的跨膜轉(zhuǎn)運量＝嵌套下室葡聚糖量/嵌套上層初始葡聚糖量×100％。