[發明專利]黃杉屬植物通過體細胞胚胎發生的繁殖方法

有效

• 申請號: 202010969083.0
• 申請日: 2020-09-15
• 公開（公告）號: CN112042541B
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 孔立生;張金鳳;趙健;高英;崔瑩;李珊珊;范英明
• 申請（專利權）人: 北京林業大學;神舟綠鵬農業科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 喻蓉

1.一種黃杉屬植物通過體細胞胚胎發生的繁殖方法，其特征是：包括如下步驟：

1）將黃杉屬植物的滅菌外植體接種于胚性組織誘導培養基上，進行誘導培養，獲得胚性組織，其中，選擇生長發育期位于多胚期和子葉期之間的種子胚胎為誘導胚性組織的外植體；所述胚性組織誘導培養基是：mLV培養基+ 2，4-D 2-6 mg/L + 6-BA 1-3 mg/ L + 水解酪蛋白400-1000mg/ L +谷氨酰胺200-600 mg/ L +蔗糖10-30 g/L+植物凝膠 2.5-3.0g/L；

2）將胚性組織接種于增殖培養基上，進行胚性組織的增殖培養，其中所述的增殖培養包括如下順序進行的步驟：

2A）將胚性組織接種到胚性組織固體增殖培養基上進行胚性組織的第一階段固體增殖培養，所述胚性組織固體增殖培養基是mLV培養基+ 2，4-D 1-3mg/L+ 6-BA 0.5-2 mg/L+水解酪蛋白200-1000mg/L+ 谷氨酰胺200-1000mg/L + 蔗糖10-30 g/L+ 植物凝膠2.5-3.0g/L；

2B）將進行了第一階段固體增殖培養后的胚性組織接種到胚性組織液體增殖培養基中，進行胚性組織的第二階段液體增殖培養，獲得增殖培養的胚性組織；所述胚性組織液體增殖培養基是mLV培養基+ 2，4-D 1-3mg/L+ 6-BA 0.5-2 mg/L+ 水解酪蛋白200-1000mg/L+ 谷氨酰胺200-1000mg/L + 蔗糖10-30 g/L；

3）將增殖培養的胚性組織接種于胚性組織前處理培養基Ⅰ中，進行胚性組織調整培養，獲得前處理胚性組織，其中，所述胚性組織前處理培養基Ⅰ是：mLV培養基+ AZa-dC 5-10 μM+ ABA 30μM+ 聚乙二醇4000 60g/L+ 水解酪蛋白400mg/L+ 谷氨酰胺200mg/L + 蔗糖10g/L+ 麥芽糖30 g/L；

4）將前處理胚性組織接種于體胚成熟培養基上，進行體胚成熟培養，獲得成熟體胚，其中，所述體胚成熟培養基是mLV培養基+ ABA 30-100 μM + PEG4000 50-100 g/L + 水解酪蛋白200-800mg/L+ 谷氨酰胺100-400mg/L + 蔗糖0-30 g/L + 麥芽糖 20-40 g/L + 植物凝膠3-8g/L；

5）將成熟體胚接種于體胚萌發培養基上，進行萌發培養，獲得體胚苗，其中所述萌發培養基是mLV培養基+ NH₄NO₃ 0.5-1.5g/L+ 水解酪蛋白200-400mg/L+ 谷氨酰胺0-200mg/L+蔗糖10-20 g/L+ 活性炭 1-3g/L+ 植物凝膠 2.0-4.0 g/L或瓊脂5.0-9.0g/L；

6）將體胚苗進行煉苗、移栽，即得。

2.如權利要求1所述的方法，其特征是，還包括步驟5A）體胚萌發前培養，在黑暗條件下，將步驟4）成熟培養獲得成熟體胚連同成熟培養基一起于4-10 ℃下暗培養 1周以上；或在黑暗條件下，將成熟培養獲得成熟體胚接種于體胚成熟培養基上，在4-10 ℃下暗培養至少1周。

3.如權利要求2所述的方法，其特征是，所述暗培養為4 ℃下，培養 2-4周。

4.如權利要求1或2所述的方法，其特征是，步驟1）中所述胚性組織的誘導培養、步驟2）中所述胚性組織的增殖培養、步驟3）中所述胚性組織調整培養、步驟4）中所述體胚成熟培養的培養條件為：黑暗條件下，培養溫度為25±2℃。