[發明專利]一種基于基因手段提升CHO生產細胞株性能的方法

在審

• 申請號: 202010968585.1
• 申請日: 2020-09-15
• 公開（公告）號: CN112029706A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 盤其偉;胡紅宇
• 申請（專利權）人: 深圳華柏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 深圳市凱卓盛世知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44672
• 代理人: 曹明蘭

1.一種基于基因手段提升CHO生產細胞株性能的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1、配制細胞培養基；

步驟2、細胞單克隆篩選；

步驟3、單克隆細胞染色體熒光原位雜交；

步驟4、分析提升CHO生產細胞株的性能的因素。

2.根據權利要求1所述的一種基于基因手段提升CHO生產細胞株性能的方法，其特征在于：所述步驟1中細胞培養基的配制過程為：

A1、首先懸浮培養中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，以CHO—K1細胞系為基礎進行配制；

A2、在培養基中添加谷氨酰胺及抗結團劑、氨基酸、可溶性維生素、無機鹽、白蛋白以及轉鐵蛋白，加入適量的注射用水至總體積的75％-80％，輕微緩慢攪拌溶解；

A3、繼續加入維生素E和維生素D，并加入0.22％的聚山梨酯，攪拌溶解，得到配制的基礎培養基溶液A液。

3.根據權利要求2所述的一種基于基因手段提升CHO生產細胞株性能的方法，其特征在于：向所述步驟A3所得A液中加入碳酸氫鈉，輕微緩慢攪拌溶解，加入適量的注射用水，攪拌配制得B液，在所得B液中用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調pH至7.2-7.4，配制得C液，所得C液中用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得細胞培養基。

4.根據權利要求1所述的一種基于基因手段提升CHO生產細胞株性能的方法，其特征在于：所述步驟2中的單克隆細胞篩選過程為：

B1、在培養基培養液中對需要克隆的細胞進行培養，待其細胞聚合至40％至80％后，進行基因轉染；

B2、在基因轉染后進行1周的細胞生長恢復，然后用能致死非基因轉染細胞的濃度的新霉素進行10-20天篩選；

B3、在B2致死性篩選后，在轉基因細胞維持生長的濃度的新霉素下，再加入含有生長因子培養液，在培養液中進行5-10天的細胞培養擴增，同時，選取能在中國倉鼠卵巢細胞中高分泌表達蛋白的信號肽，作為待選擇信號肽將待選擇信號肽分別與外源目的蛋白進行串聯，獲得重組蛋白；

B4、當B3中的轉基因細胞生長形成克隆后，用細胞刮刀刮除正常細胞，保留轉基因細胞克隆；

B5、挑選和標記選定的轉基因細胞單克隆，用0.15％-0.25％胰酶消化該單克隆細胞，并將消化后的單克隆細胞迅速置入新的培養器皿中培養擴增，培養擴增至65％-85％的細胞聚合，用0.15％-0.25％濃度的胰酶消化和懸浮上述所培養擴增的轉基因單克隆細胞，加入培養液和致死非基因轉染細胞的濃度的新霉素，繼續培養細胞，在致死非基因轉染細胞的濃度的新霉素和胰酶作用下，在培養液中致死殘留的非基因轉染細胞；

B6、將B5所得到單克隆細胞再植入新的培養器皿中培養，在轉基因細胞維持生長的濃度的新霉素條件下，再加入離心收集的該細胞對數生長期含有生長因子培養液的條件下，即可得到大量的純化的轉基因單克隆細胞。

5.根據權利要求1所述的一種基于基因手段提升CHO生產細胞株性能的方法，其特征在于：所述步驟3中的單克隆細胞染色體熒光原位雜交的過程為：通過信號肽分析工具，分析重組蛋白的氨基酸序列，選擇切割位點分析準確的重組蛋白序列上的信號肽，即為適合外源目的蛋白外分泌表達的信號肽單克隆細胞染色體熒光原位雜交。

6.根據權利要求1所述的一種基于基因手段提升CHO生產細胞株性能的方法，其特征在于：所述步驟4中提升CHO生產細胞株的性能的因素為：根據上述過程可知，pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力的物理化學條件為提升CHO生產細胞株的性能的主要因素，可以根據實際需要進行人為的控制，同時，可以施加化學、物理、生物的因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格的人為控制之下。