[發明專利]荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段的內參基因及其引物和應用

有效

• 申請號: 202010968521.1
• 申請日: 2020-09-15
• 公開（公告）號: CN112080577B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 孔廣輝;馮迪南;李雯;黃佳敏;連帥利;習平根;李敏慧;姜子德
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/31;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

本發明公開了荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段的內參基因及其引物和應用。本發明選取4個荔枝霜疫霉基因PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400，通過實時熒光定量PCR的方法測定了這些基因在荔枝霜疫霉菌絲、孢子囊、游動孢子、休止孢、休止孢萌發和侵染個階段的表達量變化，比較所選基因表達量穩定性，發現了Pl006400和PlACTIN表達量穩定可作為內參基因。本發明的內參基因Pl006400和PlACTIN的特異性引物引物可廣泛應用于荔枝霜疫霉發育及其侵染荔枝各階段的基因表達研究，填補了荔枝霜疫霉缺少可靠內參基因的空白，具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段的內參基因及其引物和應用。

背景技術

荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)所引起的荔枝霜疫病是荔枝上最嚴重的病害，在我國廣東和廣西等主要產區均有發生，每年的發病率大約在30％-90％之間，除了在荔枝生長期使其果實發病腐爛，造成落果，也會影響荔枝采摘后的保存，讓荔枝在運輸過程中大量發病，嚴重制約我國荔枝產業的發展。

實時熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性高和精確性高的優點，已被應用于分子生物學、醫學、食品檢測和環境監測等多個研究與應用領域。內參基因作為在熒光定量PCR分析中檢測基因表達水平變化的參照物，其穩定性可決定實時熒光定量的分析結果的可靠性。因此，選取穩定、合適的內參基因對分析荔枝霜疫霉基因熒光定量PCR結果有較大意義。

目前，荔枝霜疫霉內參基因的開發篩選的工作一片空白，嚴重阻礙了荔枝霜疫病的分子生物學研究，若要對荔枝霜疫霉進行生長發育和致病機制研究，可靠內參基因鑒定的是至關重要的。

發明內容

本發明針對現有技術中缺乏穩定、合適的荔枝霜疫霉內參基因及其引物的不足，提供荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段的內參基因及其引物和應用。

本發明比較了4個荔枝霜疫霉潛在的內參基因，通過熒光定量PCR發現了其中2個內參基因表達量較為穩定，可作為荔枝霜疫霉熒光定量PCR分析中的內參依據，分別是Pl006400和PlACTIN。所述的內參基因可用于荔枝霜疫霉基因表達研究。

本發明的第一個目的是提供荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段的內參基因，為內參基因Pl006400或PlACTIN，所述的內參基因Pl006400，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的內參基因PlACTIN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明的第二個目的是提供所述的荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段的內參基因的特異性引物，所述的內參基因Pl006400的正向引物和反向引物分別如SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示，所述的內參基因PlACTIN的正向引物和反向引物分別如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示。

本發明還提供所述的內參基因Pl006400或PlACTIN作為定量檢測荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段基因表達的內參基因的應用。

本發明還提供所述的特異性引物作為定量檢測荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段基因表達的內參基因特異性引物的應用。

本發明還提供所述的內參基因或所述的特異性引物在制備熒光定量試劑盒中的應用。

優選，所述的試劑盒還包括常規PCR試劑。

本發明具有以下優點：

本發明的荔枝霜疫霉生長發育和侵染階段的內參基因Pl006400或PlACTIN及其特異性引物，可廣泛應用于荔枝霜疫霉發育及其侵染荔枝各階段的基因表達研究，填補了荔枝霜疫霉缺少可靠內參基因的空白，具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1是Genorm對候選內參基因穩定性分析；