[發明專利]一種對肺炎鏈球菌19A血清型莢膜多糖抗原分子分型的LAMP檢測方法

在審

• 申請號: 202010965314.0
• 申請日: 2020-09-15
• 公開（公告）號: CN112063731A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 王磊;閆俊祥;寧可馨;曹勃陽
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12Q1/04;C12R1/46
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明涉及一種對肺炎鏈球菌19A血清型莢膜多糖抗原分型的LAMP檢測方法。本發明以肺炎鏈球菌19A的莢膜多糖基因簇內的特異基因，即wzy為靶基因，建立了對肺炎鏈球菌19A的莢膜多糖分型的四條引物，為呼吸道及水環境中肺炎鏈球菌的莢膜多糖分型提供一條可信的途徑。利用本發明的LAMP引物檢測呼吸道及水環境中的肺炎鏈球菌，并且對其進行莢膜多糖分型，具有操作簡單、快速高效、高靈敏度等諸多優點。

技術領域

本發明涉及對樣品中肺炎鏈球菌19A血清型菌株莢膜多糖分型的LAMP技術及其制備方法。本發明還設計利用所述的LAMP引物進行檢測的方法。

背景技術

ireptococcus），為兼性厭氧的革蘭氏陽性菌。肺炎鏈球菌主要分布在人體的呼吸道，是主要的粘膜病原體，一般條件下無癥狀，當人體的抵抗力下降時可引發如中耳炎、鼻竇炎與肺炎等感染，嚴重時還會引發系統性疾病如敗血癥和腦膜炎等，尤其特別容易感染年齡較大的老人、免疫系統低下的嬰幼兒以及重病患者。莢膜為其主要的致病物質，根據莢膜多糖抗原可將其分為90余種血清型，其中致病率較高的血清型有1-5、6A/B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F共23種血清型；其中，1、5、6A/B、14、19F和23F血清型這6種血清型為全球最常見的血清型。

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification）能在等溫（60-65℃）條件下，短時間（通常是一小時內）內進行核酸擴增，是一種“簡便、快速、精確、低價”的基因擴增方法。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程。環介導等溫擴增法是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。

其技術原理為：60-65℃是雙鏈DNA復性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動態平衡狀態。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶。使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環。

擴增分兩個階段：第1階段為起始階段，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。上游內部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈。FIP上的F1c與此單鏈上的F1為互補結構。自我堿基配對形成環狀結構。以此鏈為模板，下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結構的單鏈。迅速以3’末端的F1區段為起點。以自身為模板，進行DNA合成延伸形成莖環狀結構。該結構是LAMP基因擴增循環的起始結構。

第2階段是擴增循環階段。以莖環狀結構為模板，FIP與莖環的F2c區結合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。迅速以3’末端的B1區段為起點，以自身為模板，形成DNA合成延伸及鏈置換，形成長短不一的2條新莖環狀結構的DNA，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪的擴增，且產物DNA長度增加一倍。在反應體系中添加2條環狀引物LF和LB，它們也分別與莖環狀結構結合啟動鏈置換合成。周而復始，擴增的最后產物是具有不同個數莖環結構、不同長度DNA的混合物，且產物DNA為擴增靶序列的交替反向重復序列。

發明內容

為實現上述目的，本發明公開了一種對肺炎鏈球菌19A血清型莢膜多糖抗原分型的LAMP檢測方法，其主要特征在于具有從SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的DNA序列中的一種DNA序列；所述的肺炎鏈球菌莢膜多糖分型指的是：從肺炎鏈球菌19A的莢膜多糖基因簇特異基因序列。