[發(fā)明專利]胰島內(nèi)源胰島素分泌的檢測方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010963925.1
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN112048540B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳良怡;彭曉紅;王麗芬;楊璐
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 成都七星天知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51253
• 代理人: 譚美琳

本發(fā)明提供了一種胰島內(nèi)源胰島素分泌的檢測方法及應(yīng)用，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的胰島內(nèi)源胰島素分泌的檢測方法，包括將胰島貼壁培養(yǎng)后加入鋅離子熒光染料共孵育并置于顯微鏡下，然后刺激貼壁的胰島細(xì)胞分泌胰島素，觀察胰島內(nèi)源胰島素的分泌。通過貼壁培養(yǎng)胰島，并利用鋅離子與胰島素形成晶體結(jié)構(gòu)并共釋放的特性，加入鋅離子熒光染料共孵育后進(jìn)行鏡下觀察，實(shí)現(xiàn)了在胰島上實(shí)時(shí)觀察胰島素囊泡的分泌個(gè)數(shù)。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測，能夠大量縮短檢測的時(shí)間，有效提高檢測效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種胰島內(nèi)源胰島素分泌的檢測方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前常用的檢測胰島素分泌的技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、放射性免疫(RIA)、全內(nèi)反射熒光成像(Total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM)、膜電容檢測(Pacth clamp)、SRB雙光子成像等。

酶聯(lián)免疫吸附和放射性免疫技術(shù)利用抗原-抗體免疫反應(yīng)，特異性檢測溶液中的胰島素，能精確地檢測到pg級的胰島素分泌，但檢測費(fèi)用昂貴，檢測流程耗時(shí)長。

利用SRB(Sulforhodamine B，SRB)染料非選擇性標(biāo)記囊泡的Ω結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)胰島胰島素囊泡分泌觀察，但所觀察到的分泌一定程度上包含了胞吞囊泡，以及Alpha細(xì)胞和Delta細(xì)胞的分泌囊泡。且只能檢測到少量的分泌囊泡(幾十至200個(gè))。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種胰島內(nèi)源胰島素分泌的檢測方法，以至少緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述一種胰島內(nèi)源胰島素分泌的檢測方法在篩選促進(jìn)或抑制胰島素分泌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種胰島內(nèi)源胰島素分泌的檢測方法，所述方法包括：將胰島貼壁培養(yǎng)后加入鋅離子熒光染料共孵育并置于顯微鏡下，然后刺激貼壁的胰島β細(xì)胞分泌胰島素，觀察胰島內(nèi)源胰島素的分泌。

進(jìn)一步的，所述顯微鏡包括高速轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡或高內(nèi)涵成像系統(tǒng)。

進(jìn)一步的，所述鋅離子熒光染料包括不透膜鋅離子熒光染料，優(yōu)選包括FluoZin-1或RhodZin-3染料。

進(jìn)一步的，將胰島置于玻璃底的培養(yǎng)容器中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，促進(jìn)胰島貼壁。

進(jìn)一步的，貼壁培養(yǎng)所用的貼壁培養(yǎng)基包括含有葡萄糖、FBS和雙抗的RMPI1640培養(yǎng)基；

優(yōu)選地，所述貼壁培養(yǎng)基包括含有5～8mM葡萄糖、10％～15％(v/v)FBS和100U雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基。

進(jìn)一步的，所述貼壁培養(yǎng)的時(shí)間為18-36小時(shí)，所述貼壁培養(yǎng)的溫度為35-37℃。

進(jìn)一步的，將貼壁的胰島清洗后再加入鋅離子熒光染料共孵育；

優(yōu)選地，使用緩沖液對貼壁的胰島進(jìn)行清洗；

優(yōu)選地，所述緩沖液包括含有0～3mM葡萄糖的KRBB緩沖液，更優(yōu)選為預(yù)熱后的緩沖液；

優(yōu)選地，使用含有鋅離子熒光染料的緩沖液進(jìn)行共孵育；

優(yōu)選地，所述含有鋅離子熒光染料的緩沖液包括KRBB緩沖液；

優(yōu)選地，所述鋅離子熒光染料包括不透膜鋅離子熒光染料，優(yōu)選包括FluoZin-1或RhodZin-3染料；

優(yōu)選地，所述鋅離子熒光染料的含量為5～15μM；

優(yōu)選地，所述共孵育的時(shí)間為15-25min。