[發(fā)明專利]一種用于血性體液樣本腫瘤細(xì)胞的離心分層富集法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010963113.7
• 申請(qǐng)日: 2020-09-14
• 公開（公告）號(hào): CN112255072A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾賽凡;張聲;王行富;王雪丹;陳余朋;陳祥娜;任彩虹;李國(guó)平;吳平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N1/34
• 分類號(hào): G01N1/34;G01N1/36;G01N1/28
• 代理公司: 福州科揚(yáng)專利事務(wù)所 35001
• 代理人: 郭夢(mèng)羽

本發(fā)明涉及一種用于血性體液樣本腫瘤細(xì)胞的離心分層富集法，具體包括如下步驟：收集有肺腺癌原發(fā)灶且出現(xiàn)胸水轉(zhuǎn)移的病例，留取未經(jīng)固定的新鮮血性體液樣本；去除樣本中肉眼可見的蛋白和血凝塊后對(duì)樣本進(jìn)行搖勻并離心，觀察上清液與沉淀物的分層情況；對(duì)有出現(xiàn)分層的樣本觀察沉淀物大小及移動(dòng)情況；出現(xiàn)分層時(shí)，當(dāng)沉淀物小于2mL，取全部管底沉淀物，當(dāng)沉淀物大于2mL且固定在管底不移動(dòng)時(shí)，取沉血表面物；出現(xiàn)分層時(shí)，取會(huì)移動(dòng)的沉淀物與破紅液按照1:1～4的體積比進(jìn)行混勻破紅后取破紅析出物；不出現(xiàn)分層時(shí)，選取無法分層的樣本與與破紅液按照1:1～4的體積比進(jìn)行混勻破紅后取破紅析出物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于血性體液樣本腫瘤細(xì)胞的離心分層富集法，屬于醫(yī)學(xué)病理學(xué)細(xì)胞病理分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人體幾乎所有系統(tǒng)的惡心腫瘤都可能發(fā)生漿膜腔播散，以肺癌、胃腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多見，其中肺腺癌的轉(zhuǎn)移最常見，多由腫瘤細(xì)胞破壞或瘤栓阻塞淋巴管、血管引起，因此常形成血性漿膜腔積液，通過漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)往往可進(jìn)行早期診斷。胸腺癌轉(zhuǎn)移至胸腺或心包所產(chǎn)生的血性胸腔積液或心包積液肉眼可呈現(xiàn)深淺不一的紅色，對(duì)于深紅色的濃血性胸水常常因?yàn)槿〔臅r(shí)紅細(xì)胞過多、而有效腫瘤細(xì)胞較少；紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞及蛋白粘液等成分混合，干擾了腫瘤細(xì)胞的分離等原因?qū)罄m(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色和分子檢測(cè)造成困擾，從而發(fā)生漏診或假陰性，因此，進(jìn)行漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)時(shí)如何破壞紅細(xì)胞，使得樣本分層富集腫瘤細(xì)胞，使得腫瘤細(xì)胞更為集中，并保持完整的細(xì)胞形態(tài)和良好的抗原性，是提高此類樣本的細(xì)胞病理檢出率的關(guān)鍵所在。

目前，漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)中有采用％乙酸乙醇來處理血性積液，乙酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的膨脹和乙醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的收縮可以相互抵消，對(duì)于離心分層后沉淀物會(huì)移動(dòng)的血性胸水中呈現(xiàn)紅細(xì)胞溶解背景干凈，但是，在這一過程中無法分層的血性胸水中乙酸溶解紅細(xì)胞的碎片會(huì)加深染色的背景，而且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性肺腺癌的血性胸水中，單獨(dú)使用乙酸或是混合液作為破紅處理劑的病例， TTF-1抗體細(xì)胞核標(biāo)記無或少表達(dá)，可能是乙酸快速的沉淀核蛋白使得TTF-1蛋白丟失。現(xiàn)有技術(shù)中還有用新柏氏細(xì)胞清洗液溶解紅細(xì)胞，此類清洗液主要是醇類的成分，對(duì)于離心分層后沉淀物會(huì)移動(dòng)的血性胸水去除紅細(xì)胞，富集腫瘤細(xì)胞的效果良好，但醇類會(huì)沉淀無法分層的血性胸水中肉眼看不見的蛋白等，使得腫瘤細(xì)胞分散，細(xì)胞輕度收縮。因此，在漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)中亟需一種能夠溶解紅細(xì)胞以避免紅細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的干擾和掩蓋，同時(shí)能夠保存血性體液中腫瘤細(xì)胞形態(tài)的完整和良好抗原性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種用于血性體液樣本腫瘤細(xì)胞的離心分層富集法，能夠同時(shí)完成紅細(xì)胞溶解和有核細(xì)胞集中保護(hù)兩個(gè)過程，避免紅細(xì)胞對(duì)有核細(xì)胞分離的干擾。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于血性體液樣本腫瘤細(xì)胞的離心分層富集法，具體包括如下步驟：

(1)收集有肺腺癌原發(fā)灶且出現(xiàn)胸水轉(zhuǎn)移的病例，留取未經(jīng)固定的新鮮血性體液樣本；

(2)立即去除樣本中肉眼可見的蛋白和血凝塊后對(duì)樣本進(jìn)行搖勻并離心，觀察上清液與沉淀物的分層情況；

(3)對(duì)有出現(xiàn)分層的樣本觀察沉淀物大小及移動(dòng)情況；出現(xiàn)分層時(shí)，當(dāng)沉淀物小于2mL，取全部管底沉淀物，當(dāng)沉淀物大于2mL且固定在管底不移動(dòng)時(shí)，取沉血表面物；

(4)經(jīng)過步驟(3)分層沉淀處理后，出現(xiàn)分層時(shí)，取會(huì)移動(dòng)的沉淀物與破紅液按照1:1～4的體積比進(jìn)行混勻破紅后取破紅析出物；不出現(xiàn)分層時(shí)，選取無法分層的樣本與與破紅液按照1:1～4的體積比進(jìn)行混勻破紅后取破紅析出物；

(5)取經(jīng)過步驟(3)獲得的管底沉淀物、沉血表面物以及經(jīng)過步驟(4) 獲得的破紅析出物分別制成細(xì)胞蠟塊；

(6)經(jīng)過步驟(5)制得的細(xì)胞蠟塊切片，行蘇木素伊紅染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色及分子病理檢測(cè)。