[發明專利]表達分泌抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體的重組乳酸乳球菌及其制備方法

有效

• 申請號: 202010962886.3
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN112080455B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 朱建國;張凡慶;王鳳青;張蕾;閆潔新;程曼玲
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/13;C12N15/74;A61K35/744;A61P1/00;C12R1/01
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種重組乳酸乳球菌，其特征在于，該重組乳酸乳球菌分泌的抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體TZZ19的融合序列的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述的重組乳酸乳球菌分泌的單鏈抗體TZZ19具有與豬傳染性胃腸炎病毒結合的活性，以及中和豬傳染性胃腸炎病毒感染細胞的作用。

2.根據權利要求1所述的重組乳酸乳球菌，其特征是，所述的重組乳酸乳球菌，具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，該核苷酸序列中進一步包含內切酶位點NcoI、HindIII，其中Nco I為CCATGG，HindIII為AAGCTT。

3.一種制備權利要求1或2所述的重組乳酸乳球菌的方法，其特征在于，通過將合成密碼子優化的單鏈抗體序列Seq ID No.2和合成分泌信號肽和硫氧還蛋白的序列Seq IDNo.1的基因酶切克隆到乳酸乳球菌載體pNZ8148中構建得到重組質粒pNZ8148-TZZ 19，通過電轉化入乳酸乳球菌NZ9000感受態細胞，經培養分離純化獲得分泌表達單鏈抗體TZZ19。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征是，具體包括：

①設計帶有分泌信號肽USP45、分泌增強信號肽LEISSTCDA和硫氧還蛋白A基因trxA的序列，在5’端加上Nco I酶切位點，在3’端加上EcoRI，并且在trxA基因兩端加上Kpn I，得到Seq ID No.1序列；將抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體TZZ 19的核苷酸序列用CodonOptimWiz軟件優化密碼子，在5’端加上EcoRI，在3’端加上6×His序列和HindIII，得到SeqID No.2序列；

②分別將合成的Seq ID No.1序列、合成的Seq ID No.2序列依次連入pNZ8148，轉化MC1061F-感受態細胞，得到攜帶Seq ID No.3序列的重組質粒pNZ8148-USP45-LEISSTCDA-trxA-TZZ 19，即pNZ8148-TZZ 19；

③從-80℃取出乳酸乳球菌電轉化感受態細胞NZ9000，加入10μL連接產物，冰上放置10min后轉移至電極杯，經電轉和培養后得到重組攜帶抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體的重組乳酸乳球菌。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征是，所述的電轉，電擊參數為：電壓為2.5kv，電阻為200Ω，電容為25μF。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征是，所述的培養是指：電轉后加入1mL預熱的SGM17B復蘇培養基，30℃靜置培養1.5h后涂布至帶氯霉素抗性的SGM17B平板，30℃培養2天后從平板上挑取單菌落，即得到重組攜帶抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體的重組乳酸乳球菌。

7.一種根據權利要求1～6中任一所述重組乳酸乳球菌的應用，其特征在于，具體為制備用于仔豬傳染性胃腸炎病的仔豬口服藥物。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征是，所述的仔豬口服藥物，為每天兩次口服的20mL濃度為10⁹cfu/mL的分泌表達單鏈抗體TZZ 19的重組乳酸乳球菌。