[發明專利]核酸酶介導的DNA組裝

在審

• 申請號: 202010960987.7
• 申請日: 2015-06-23
• 公開（公告）號: CN112029787A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 克里斯·舒恩赫;約翰·麥克沃特;科里·莫蒙;林恩·麥克唐納;安德魯·J.·墨菲;格雷格·S.·沃肖;約瑟·F.·羅哈斯;卡曼·維納斯·萊;大衛·M.·巴倫蘇埃拉;凱特琳·蒙塔尼亞
• 申請（專利權）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: C12N15/64
• 分類號: C12N15/64;C12N15/66;C12N15/10
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種用于組裝至少兩個核酸的方法，包括：

(a)使第一核酸與第一核酸酶試劑接觸，其中所述第一核酸酶試劑在第一靶位點處切割所述第一核酸，以產生第一經酶切的核酸，在所述第一經酶切的核酸與第二核酸之間具有重疊末端序列；

(b)使所述第一經酶切的核酸和所述第二核酸與核酸外切酶接觸，以暴露所述第一經酶切的核酸與所述第二核酸之間的互補序列；以及

(c)組裝由步驟(b)生成的所述兩個核酸片段。

2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(c)還包括：

(i)使所述暴露的互補序列退火；

(ii)延伸所述經退火的互補序列的3’端；以及

(iii)連接所述第一核酸和所述第二核酸。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟(a)還包括使所述第二核酸與第二核酸酶試劑接觸，其中所述第二核酸不包含所述重疊末端序列，并且所述第二核酸酶試劑在第二靶位點處切割所述第二核酸，以產生第二經酶切的核酸，在所述第一經酶切的核酸與所述第二經酶切的核酸之間具有所述重疊末端序列，并且，

其中步驟(b)的所述第二核酸是所述第二經酶切的核酸。

4.根據權利要求3所述的方法，其中所述第一核酸酶試劑和所述第二核酸酶試劑中的至少一者包含靶向所述第一靶位點或所述第二靶位點的Cas9蛋白和向導RNA(gRNA)(gRNA-Cas復合物)、鋅指核酸酶或轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述第一核酸酶試劑和所述第二核酸酶試劑中的至少一者包含所述Cas蛋白和所述向導RNA(gRNA)(gRNA-Cas復合物)，

其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白，所述gRNA包含編碼成簇的規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的核酸序列，并且所述第一靶位點和所述第二靶位點中的至少一者被前間區序列鄰近基序(PAM)序列緊鄰地側接。

6.根據權利要求5所述的方法，其中所述Cas9蛋白包含RuvC結構域和HNH結構域，所述兩個結構域中的至少一者缺少核酸內切酶活性。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述重疊末端序列的長度在20bp至200bp的范圍內。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸或這兩個核酸衍生自細菌人工染色體。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述細菌人工染色體包含人DNA、嚙齒動物DNA、合成DNA、人多核苷酸序列或它們的組合。

10.一種用于組裝至少兩個核酸的方法，包括：

(a)使第一核酸與第一核酸酶試劑和第二核酸酶試劑接觸以產生第一經酶切的核酸，其中所述第一核酸酶試劑在所述第一核酸的第一鏈上的第一靶位點處生成切口，并且所述第二核酸酶試劑在所述第一核酸的第二鏈上的第二靶位點處生成切口，以產生在其末端之一處包含5′或3′懸垂序列的所述第一經酶切的核酸；

(b)使所述第一經酶切的核酸和包含與所述5′或3′懸垂序列互補的序列的第二核酸退火；以及

(c)連接所述第一經酶切的核酸和所述第二核酸。

11.根據權利要求10所述的方法，其中步驟(b)還包括使用所述第二鏈作為模板來延伸所述第一鏈的3’端，并且使用所述第一鏈作為模板來延伸所述第二鏈的3’端。

12.根據權利要求10或11所述的方法，其中所述第一核酸酶試劑和所述第二核酸酶試劑中的至少一者包含靶向所述第一靶位點或所述第二靶位點的Cas9蛋白和向導RNA(gRNA)(gRNA-Cas復合物)。