[發(fā)明專利]一種重組蛋白酶K工業(yè)化純化及凍干方法

在審

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• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN114181925A
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設計）人: 占全;楊代常
• 申請（專利權）人: 武漢禾元生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58
• 代理公司: 北京律誠同業(yè)知識產(chǎn)權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏;魏紫

本發(fā)明公開了一種重組蛋白酶K工業(yè)化純化及凍干方法。將畢赤酵母表達的重組蛋白酶K發(fā)酵液澄清過濾后加入稀釋液稀釋，并經(jīng)過超濾步驟進行濃縮和透析，獲得含微量金屬離子和色素的蛋白酶K透析液，將該透析液經(jīng)過陽離子交換層析分離純化，獲得含重組蛋白酶K的洗脫液；將含重組蛋白酶K的洗脫液放在室溫結晶沉淀4?6h，攪拌混勻后倒入正壓過濾裝置中，壓濾獲得蛋白酶K濾餅；該濾餅復溶后，加入凍干賦形劑，按照優(yōu)化的凍干工藝進行凍干，分包裝后獲得蛋白酶K成品。該方法工藝步驟簡單、收率高、成本低，易于工業(yè)化放大生產(chǎn)。所獲得的蛋白酶K目標物產(chǎn)量高、活性好。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組蛋白酶K工業(yè)化純化及凍干的方法。

背景技術

蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌(Tritirachiumalbum limber)的提取物純化獲得。主要切割位點為脂族或芳香族等厭水性氨基酸的羧基端的肽鍵。研究表明，該酶在pH 4～12、20℃～60℃的條件下均有活性，在SDS、尿素、螯合劑(如EDTA)及巰基試劑(如胰蛋白酶抑制劑或糜蛋白酶抑制劑)中也具有切割蛋白質(zhì)的能力。因而它的應用十分廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體DNA、蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。

蛋白酶K的應用并不僅僅局限在醫(yī)療診斷及科研領域，在工業(yè)制革、造紙、飼料等領域中也可以替代傳統(tǒng)的可能存在污染的化學方法處理原材料。因此，利用基因工程技術和蛋白質(zhì)工程技術，獲得活性高、成本低的蛋白酶K具有較大的社會價值和經(jīng)濟價值。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)的基因重組蛋白酶K是以原核細胞(如大腸桿菌)和真核細胞(酵母)為宿主。利用大腸桿菌為宿主其優(yōu)點是簡便、經(jīng)濟。然而，該系統(tǒng)表達得到的蛋白酶K活性不高、產(chǎn)量過低，難以滿足市場需求。利用酵母為宿主在重組蛋白酶K的C端添加的六聚組氨酸標簽，發(fā)酵液需經(jīng)過離心、金屬螯合柱層析和弱陽離子交換柱層析分離、大孔脫色膠脫色處理等步驟，工藝步驟較復雜。鑒于蛋白酶K的應用價值，需要開發(fā)快速，經(jīng)濟適宜于工業(yè)規(guī)模化和連續(xù)化生產(chǎn)的分離純化技術。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種重組蛋白酶K工業(yè)化純化及凍干方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

一種從畢赤酵母中分離純化重組蛋白酶K的層析方法，依次包括以下步驟：

1)將畢赤酵母表達的重組蛋白酶K發(fā)酵液上清進行澄清處理，然后加入等體積的稀釋液稀釋后混勻。采用超濾膜包對稀釋后發(fā)酵上清進行濃縮，濃縮至終點后，加入等體積透析液進行多次透析，得到含有微量金屬離子和色素的蛋白酶K透析液。其中超濾膜包可選擇Millipore 5kD、10kD或者Sartorius 5kD、10kD。優(yōu)選的膜包截留孔徑為5kD。

2)將含有少量金屬離子和色素的重組蛋白酶K的透析液，調(diào)節(jié)pH和電導后經(jīng)陽離子交換層析，得到含有較高濃度的蛋白酶K洗脫液。其中陽離子交換層析的填料選自NanoGel 30/50SP、UniGel 30/80SP、SP Bestarose FF、SP Bestarose HP、BestaroseDiomond MMC、Uniphere S、MacroPrep S、POROS XS、SP-6FF、SP-6HP、SP Sepharose^TM FastFlow。在一種實施方式中，陽離子交換層析的填料優(yōu)選為SP Bestarose FF。陽離子交換層析可選擇pH或鹽度梯度洗脫，優(yōu)選氯化鈉梯度洗脫。

3)將得到的蛋白酶K洗脫液，在室溫下進行結晶沉淀，在進行結晶沉淀前，優(yōu)選將所述蛋白酶K洗脫液調(diào)節(jié)為蛋白濃度在40～50mg/ml范圍內(nèi)。沉淀結束后，采用正壓過濾裝置獲得蛋白酶K沉淀濾餅。其中過濾紙板為沈陽長城過濾紙板，濾板孔徑為0.2～5μm，優(yōu)選為2.5～5μm。