[發明專利]一種雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法

在審

• 申請號: 202010950403.8
• 申請日: 2020-09-11
• 公開（公告）號: CN112011562A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 劉振云;王旭;程豐偉;郭濤;倪磊
• 申請（專利權）人: 蘇州一兮生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N15/113
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

1.一種雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法，其特征在于，所述雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法基于Gibson Assembly介導。

2.根據權利要求1所述的雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法，其特征在于，進行GibsonAssembly時，連接三個片段，所連接的三個片段每兩個片段之間的重疊序列含有15-30個堿基，每個片段使用了0.33pmol的量，共1pmol；之后的50℃水浴時間選擇了45min。

3.根據權利要求1所述的雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法，其特征在于，所述方法包含如下步驟：

步驟a.設計擴增gRNA和環p的引物，在環p的引物中添加了酶切位點Spe Ⅰ,Acc65 Ⅰ兩側的序列；

步驟b.設計四個長引物合成gRNA2目標片段；

步驟c.構建含雙gRNA的pTargetF質粒：

利用Gibson Assembly技術，將上述步驟所獲得的目標片段進行連接

Gibson Assembly體系

ddH2O加至20ml

水浴45min；

步驟d.步驟c連接產物進行轉化進入DH5α中，挑取陽性克隆菌株并進行基因測序，最后提取目的質粒。

4.根據權利要求3所述的雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法，其特征在于，所述步驟a使用：

gRNA1-F SEQ ID No.1；

gRNA1-R SEQ ID No.2；

環p-F SEQ ID No.3；

環p-R SEQ ID No.4；

以pTargetF質粒為模板，利用上述所設計的引物進行PCR擴增獲得目標片段gRNA1,HP。

5.根據權利要求3所述的雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法，其特征在于，所述步驟b使用：

L1-F SEQ ID No.5；

L2-R SEQ ID No.6；

L3-F SEQ ID No.7；

L4-R SEQ ID No.8；

四個長引物分別取2.5ug，配成50ml PCR反應體系直接變性，退火，延伸2-3個循環獲得目標片段gRNA2。。

6.根據權利要求4所述的雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法，其特征在于，所述步驟a中gRNA1片段PCR擴展條件為：

HP片段PCR擴展條件為：

7.根據權利要求5所述的雙gRNA-pTargetF質粒的構造方法，其特征在于，所述步驟b中片段gRNA2 PCR擴展條件為：

DdH₂O加至50ul。