[發明專利]編碼BDNF的核酸及其應用

有效

• 申請號: 202010947013.5
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN112029773B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 李斌;劉婷
• 申請（專利權）人: 武漢紐福斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/864;A61K48/00;A61K38/18;A61P27/02;A61P27/06
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及編碼BDNF的核酸及其應用。本發明通過密碼子優化，獲得了體內高效表達的BDNF片段，由此構建了高效表達BDNF的AAV載體、腺相關病毒以及治療眼部疾病的藥物。實驗表明，攜帶BDNF基因的AAV病毒能夠直接感染視網膜神經節細胞，并在靶細胞中持續表達保護和促進視神經再生的BDNF蛋白，從而保護視神經損傷后的視網膜神經細胞。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及編碼BDNF的核酸及其應用。

背景技術

視神經屬于中樞性傳導束，視神經損傷是視神經傳導通路內某種病因所致傳導功能障礙的疾病。常見的病因有外傷、缺血、中毒、脫髓鞘、腫瘤壓迫、炎癥、代謝等。視神經損傷后，視網膜神經節細胞(RGCs)大量死亡，軸突再生困難，最終導致視神經萎縮以及視功能受損。目前，視神經損傷造成的視功能受損尚無治療方法。

神經營養因子是一類誘導神經元存活、發展和發揮作用的蛋白家族。其中，腦源性神經生長因子BDNF是一種分泌性的二聚體生長因子，存在于大多數人體組織中，包括大腦和血液。BDNF對特定神經元種群發育過程中的存活和分化以及成年期神經元網絡的維持和可塑性中起著重要作用。BDNF首先被合成為一種32kDa的前體蛋白，然后被不同的蛋白酶剪切，產生14kDa的成熟形式或28kDa的截短形式。成熟形式BDNF結合并激活Trk受體酪氨酸激酶家族成員TrkB。Trk受體反過來會激活三種主要的信號轉導通路：(1)促進神經元分化和神經突增生的Ras-MAPK信號轉導；(2)促進神經元存活和生長的PI3激酶-Akt信號轉導；以及(3)促進突觸可塑性的PLC-γ1-PKC信號轉導。

已有動物實驗數據表明BDNF對于受損的視神經具有一定的保護作用，但是由于BDNF是生物大分子，很難穿過血腦屏障，因此治療效果并不十分理想。例如，專利文獻CN102639111A公開了一種滴眼劑形式的眼制劑，其含有腦源性神經營養因子(BDNF)和粘度控制劑，優選從羅望子(tamarind)種子中提取的半乳糖木糖葡聚糖，也稱為TS多糖或TSP。實施例2.2的結果表明使用人工淚液(尤其是基于TSP的)攜帶的BDNF長期治療時，需要每隔12小時一次局部應用以使BDNF在視網膜中維持較高水平。

攜帶BDNF基因的AAV病毒能夠直接感染視網膜神經節細胞，并在靶細胞中持續表達保護和促進視神經再生的BDNF蛋白。由于BDNF是分泌型蛋白，即使沒有感染AAV的神經節細胞也可以受到來自其他細胞分泌的BDNF蛋白的激活和保護作用。因此，構建高效表達BDNF的AAV載體對于慢性或急性視神經損傷等疾病的治療有十分重要的臨床意義。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供編碼BDNF的核酸、并提供表達BDNF的腺相關病毒載體，并將它們應用于制備治療急性或慢性視神經相關疾病的藥物。

本發明提供的編碼腦源性神經生長因子的核酸，包括I)～IV)中至少一種：

I)、具有如SEQ ID NO:3～6任一項所示核苷酸序列的核酸；

II)、在I)所述的片段中取代、缺失或添加一個或多個核苷酸的核酸；

III)、與I)所述核酸的序列至少具有85％的同源性，且編碼如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白的核酸；

IV)、與I)～III)中任一項部分互補或完全互補的核酸。

本發明還提供了腦源性神經生長因子的轉錄單元，其包括：啟動子、所述的核酸和終止子。

本發明還提供了重組載體，其包括骨架載體和所述的核酸。

本發明所述的重組載體為其為病毒載體；

所述病毒載體選自慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體中至少一種；其中，腺相關病毒載體的血清型為AAV2、AAV5、AAV7或AAV8。