[發(fā)明專利]一種超高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定當(dāng)歸中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010945584.5
• 申請(qǐng)日: 2020-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN112198242A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嚴(yán)博豪;朱帆;傅華鋒;陸慧;李仲元;王藍(lán)青;陳丹丹;董潔;黃松桐;沈子良
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州漢庫(kù)醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 杭州恒翌專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33298
• 代理人: 王從友;柯奇君

本發(fā)明公開了一種超高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定當(dāng)歸中黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的方法，其特征在于，具體包含以下步驟：步驟1、樣品制備；步驟2：樣品提?。徊襟E3：免疫親和萃取富集當(dāng)歸中待測(cè)物；步驟4：樣品洗脫；步驟5：利用超高效色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜上機(jī)測(cè)定。本發(fā)明吸收了免疫親和萃取良好的富集能力與超高效液相良好的分離能力及較快的分離時(shí)間，以及特殊提取溶劑使得檢測(cè)當(dāng)歸中各類痕量黃曲霉毒素想過顯著。本發(fā)明通過對(duì)提取溶劑、稀釋溶劑、液相分離流動(dòng)相、質(zhì)譜條件等重要方面均進(jìn)行了探索和試驗(yàn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種黃曲霉毒素檢測(cè)方法，尤其涉及一種超高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定當(dāng)歸中黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的方法，該方法能夠時(shí)間對(duì)不同產(chǎn)地的當(dāng)歸中痕量黃曲霉毒素的高效，準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，特別提供一種以正己烷飽和的乙腈提取方式，經(jīng)免疫親和固相萃取方式對(duì)樣品預(yù)處理，基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)同時(shí)檢測(cè)當(dāng)歸中黃曲霉毒素類4種生物毒素。

技術(shù)背景

黃曲霉毒素(AF)及其產(chǎn)生菌在自然界中分布廣泛，有些菌株產(chǎn)生不止一種類型的黃曲霉毒素，自1962年分離出黃曲霉毒素以來，人們對(duì)其毒性進(jìn)行了較深入的研究，發(fā)現(xiàn)其毒性屬于極毒，其劇烈的毒性比人們熟知的劇毒藥氰化鉀要強(qiáng)10倍，北京醫(yī)科大學(xué)曾用含20μg/kg黃曲霉毒素的飼料喂大鼠一年后即發(fā)肝癌。國(guó)外有報(bào)道說，AF為1μg/kg時(shí)即可誘發(fā)癌變，人攝入大劑量的黃曲霉毒素后可出現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死、膽管上皮細(xì)胞增生、肝脂肪浸潤(rùn)及肝出血等急性病變，前期癥狀為發(fā)燒、嘔吐、厭食、黃疸，繼而出現(xiàn)腹水，下肢浮腫并很快死亡，而慢性毒性表現(xiàn)為生長(zhǎng)障礙，肝臟出現(xiàn)亞急性或慢性損傷，體重減輕，誘發(fā)肝癌等。目前已經(jīng)從各類中藥材中檢出黃曲霉毒素。隨著黃曲霉毒素污染中藥材越來越多。因此，有必要建立一種能實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材中痕量黃曲霉毒素的高效，準(zhǔn)確檢測(cè)方法，為中藥材質(zhì)量提供技術(shù)支持。

目前，國(guó)內(nèi)和國(guó)際有關(guān)當(dāng)歸中黃曲霉毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)十分有限，在我國(guó)現(xiàn)行的2015 版中國(guó)藥典中，對(duì)各類中藥材采取的前處理方法統(tǒng)一使用70％甲醇作為提取溶劑，且使用的第一法高效液相-柱后衍生熒光法容易造成假陽(yáng)性的結(jié)果，第二法高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法最低檢測(cè)濃度僅為0.04ng/ml，第三法酶聯(lián)免疫發(fā)操作復(fù)雜繁瑣，靈敏度較低，在一定程度上不能實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確檢測(cè)。

用于黃曲霉毒素在自然界中分布廣泛，各類中藥材基質(zhì)復(fù)雜，濃度通常為納克的水平。這就要求黃曲霉毒素的檢測(cè)方法不僅要有良好的抗干擾性，同時(shí)對(duì)于低濃度的檢測(cè)還需要有較強(qiáng)的靈敏性與可量化性。隨著科技的發(fā)展，近幾年高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS)等新技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，更使精確定性定量中藥材中黃曲霉毒素變?yōu)榭赡?，但是這些方法并不能通用于每一種中藥材，不適用于復(fù)雜基質(zhì)的分析檢測(cè)。

近年來，國(guó)內(nèi)外許多研究人員針對(duì)各類中藥材中黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)方法開展了多方面的探索試驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的欠缺，目的在于提供一種以免疫親和固相萃取方式對(duì)樣品預(yù)處理，基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)當(dāng)歸中黃曲霉毒素B₁、B₂、 G₁、G₂的方法。

本發(fā)明的目的使通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的

一種超高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定當(dāng)歸中黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的方法，具體包含以下步驟

步驟1、樣品制備：對(duì)當(dāng)歸進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)當(dāng)歸進(jìn)行預(yù)處理，稱取適量當(dāng)歸在真空干燥箱95-110℃烘烤以除去藥材中的水分，冷卻后使用中藥材粉碎機(jī)粉碎，過標(biāo)準(zhǔn)篩 (200-800μm)備用。