[發明專利]一種NK樣細胞的培養方法

在審

• 申請號: 202010942374.0
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112048482A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 湯朝陽;秦樂;吳迪;魏志輝;王翠花;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 廣東昭泰體內生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種NK樣細胞的培養方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)將靶向Bcl11b基因的RNP復合物電轉入活化的T細胞，得到NK樣細胞；

(2)將所述NK樣細胞與人工抗原呈遞細胞共培養；

其中，所述RNP復合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述T細胞來源于外周血和/或臍帶血。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述活化的T細胞采用抗人CD3抗體和抗人CD28抗體進行；

優選地，所述抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的摩爾比為(1～5):1。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述crRNA包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

優選地，所述tracrRNA包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述電轉的電壓為800～2500V；

優選地，所述電轉的時間為1～8ms；

優選地，對于2mm電擊杯，所述電轉的電壓為1000～2000V，時間為1～4ms。

6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述人工抗原呈遞細胞包括表達IL-15的K562細胞、表達OX40L的K562細胞或表達IL-15和OX40L的K562細胞中的任意一種或至少兩種的組合；

優選地，所述人工抗原遞呈細胞經γ射線或絲裂霉素C處理；

優選地，所述γ射線的強度為100～200Gy；

優選地，所述絲裂霉素C的濃度為10～20μg/mL。

7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述NK樣細胞與所述人工抗原呈遞細胞的數量比為1:(0.1～10)；

優選地，所述共培養的時間為3～14天。

8.根據權利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)從外周血和/或臍帶血中分離單個核細胞并分選得到T細胞，采用摩爾比為(1～5):1的抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的組合活化T細胞；

(2)將靶向Bcl11b基因的RNP復合物在電壓為1000～2000V的條件下電轉入活化的T細胞，所述電轉的時間為1～4ms；

(3)將電轉后的細胞與人工抗原呈遞細胞按照1:(0.1～10)的比例共培養3～14天，所述人工抗原遞呈細胞預先經100～200Gyγ射線或10～20μg/mL絲裂霉素C處理。

9.一種NK樣細胞，其特征在于，所述NK樣細胞采用權利要求1-8任一項所述的方法培養得到。

10.權利要求9所述的NK樣細胞在制備腫瘤免疫治療藥物中的應用；

優選地，所述腫瘤包括實體瘤和/或血液腫瘤；

優選地，所述實體瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、腎母細胞瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、間皮質瘤、胰島細胞瘤、視網膜母細胞瘤、胰腺癌、子宮肌瘤、宮頸癌或甲狀腺癌中的任意一種或至少兩種的組合；

優選地，所述血液腫瘤包括急性髓細胞白血病、多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤或漿細胞樣樹突細胞腫瘤中的任意一種或至少兩種的組合。